生物大分子分离与提取 实验教学方案_生物大分子的提取
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生物大分子分离与提取
实验教学方案
实验一 鸡蛋黄中卵磷脂的分离、纯化与鉴定 实验目的：
• • • • 了解从生物组织中提取生物分子的一般原理和方法
掌握从鸡蛋黄中提取卵磷脂的原理和方法
掌握卵磷脂的鉴定方法
鸡蛋，水浴锅，真空泵，蒸发皿，试管，研钵，氢氧化钠，硫酸铜，乙醇，丙酮，氯仿
实验原理：
• 卵磷脂是生物膜的成分，具有多种生物功能，鸡蛋黄中卵磷脂含量高达8%。卵磷脂、脂肪都溶于乙醇，而蛋白质、脑磷脂等在乙醇中形成沉淀，因此用乙醇溶液将蛋黄分成两部分。卵磷脂溶于氯仿而不溶于丙酮，因而可用丙酮将卵磷脂沉淀。
• • • 实验材料、药品与设备：
• •
四置于沸水浴上以蒸发掉乙醇，得到黄色油状物（注意：属于脂类混合物）。第三步：冷却后，加入2-3 ml氯仿，搅拌使溶解（注意：各种脂类都溶解于氯仿）。
第四步：边搅拌边加入10-15 ml丙酮，卵磷脂析出。搅动使其粘附于玻棒上，溶液倒入回收瓶内。（注意：所用技术为有机溶剂沉淀法）
2.卵磷脂的鉴定
（1）卵磷脂的水解：将卵磷脂转移到试管内，加入5 ml 10%氢氧化钠溶液，放入沸水中加热10 min，用玻棒搅拌，卵磷脂水解。冷却后，在玻璃漏斗中用棉花过滤。收集滤液备用。
（2）脂肪酸的检查：取棉花上的沉淀少许，加5ml水，搅拌，有何现象？过滤，滤液中加入浓硝酸，再滴10%醋酸铅溶液，观察有何现象？
（3）甘油的检查：取小试管一支，加入1滴5%硫酸铜溶液，2滴10%氢氧化钠溶液，振荡，产生氢氧化铜沉淀。再加入水解液，沉淀溶解，得深蓝色甘油铜溶液。•
（4）胆碱检测：取1ml水解液，滴加浓硫酸，至中和（用蓝色石蕊试纸检查），然后加克劳特试剂1滴，产生夸红色沉淀。•
（5）磷酸的检查：取1支试管，加入10滴水解液和5滴95%乙醇溶液，再加硝酸
使其酸化，然后加入1ml钼酸铵试剂，观察有何现象产生？最后直接用火加热5-10min，观察黄色磷钼酸铵沉淀的生成作业：
撰写实验报告（长度2000字以上）
实验二 奶粉中酪蛋白的检测
实验目的：
• • •
了解奶粉中的酪蛋白特点 掌握奶粉中蛋白质的提取方法 酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，约占乳蛋白的80~82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在实验步骤： 1．卵磷脂的提取：
• 第一步：1个鸡蛋，煮熟，取蛋黄，研钵中研细，加95%乙醇15ml，再研磨，搅拌均匀。减压过滤，收集滤液。残渣移入研钵内，再加同量乙醇，研磨，过滤。将两次滤液合并。（注意：滤液应当完全透明）• 第二步：将滤液集中到蒸发皿里，将蒸发
实验原理：牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质，可以检测牛乳中是否掺假。• 酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，经牛乳调到pH4.6，酪蛋白就从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去。
作业：
准确称重后，计算出每100g奶粉所含有的酪蛋白量。或者：100ml牛乳所制备出的酪蛋白数量（g%），并与理论产量（3.5g%）相比较，求出实际获得百分率。做出实验报告（长度2000字以上）
实验二 果汁中糖的检测
实验目的：
• •
了解薄层色谱法的分离原理
掌握薄层色谱法鉴定果汁中的糖的操作技术。
实验原理：
对多组分的复杂混合物，无论是有机物或无机物，薄层色谱法是有效的分离技术之一。•
硅胶是常用的吸附剂，在一定条件下，硅胶对各种糖分的吸附能力不同。同时，选择适当的展开剂，利用各种糖分的分配系数的差异，可能达到分离的目的。显色后得到的色谱图与已知糖分的色谱图比较，即可鉴定果汁中的糖分。•
未知物组分的鉴定是通过在同一块薄层板上分别点上标准样品和未知样品，通过比较斑点的比移值来定性鉴定。比移值公式：Rf=原点到斑点中心的距离/原点到展开剂前沿的距离 •
相同条件下，物质的Rf值是一定的，因而可用其作为定性分析的参考。分离后，可能用适当的方法定量测定。将被测物浸取后用比色法测定其含量，或用薄层扫描仪直接测出。
实验材料：
• •
汇源果汁
层析缸，微量注射器，薄层板，吸附剂，硅胶G，正丁醇，丙酮，苯胺，硫酸，果糖，葡萄糖，乳糖，异丙醇，无水乙醇
实验步骤：
1.制作薄层板：将玻璃板洗净至不挂水，晾干后置于干燥处备用。将10克硅胶G加适量的水，在研钵中沿一个方向研磨，制成均匀的胶浆，立即倾倒于玻璃板中央，迅速振荡，使硅胶均匀。涂布好的薄层板于室温下晾干，并在105C温度下活
o实验步骤：
• 1.酪蛋白等电点沉淀
将10g奶粉溶解到100ml水中，在500ml烧杯中进行。加热至40℃左右，再慢慢加入同温度的乙酸钠缓冲液以调节酸碱度，直到pH达4.6左右，用pH试纸或酸度计调试。将上述悬浮液冷却至室温，然后放置5min，用细布过滤，收集沉淀。• 2.除脂类杂质
将上述沉淀用少量水洗数次，然后悬浮于30ml95%的乙醇中。将此悬浮液倾于布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再倒入乙醇—乙醚混合液洗涤沉淀两次，最后再用乙醚洗涤沉淀两次，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移到到表面皿，在表面皿上摊开以除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白纯品。• 3.计算
•化30min，贮于干燥器中备用。硅交厚度约为0.1mm，用前用氯仿-甲醇（8：2）预洗，105oC温度下加热1h。• 点样：距色谱板底边2cm处用铅笔划线，用微注射器或玻璃毛细管点样，各斑点之间相距2cm ,直径不过2mm，每个样品点4次，每次点样后用冷风吹干或自然干燥。在板上标出起始线和欲展开的前沿线，一般展开距离为7cm以上。• 展开：点样后的薄层板在空气中晾干，将配好的展开剂倒入展开缸中，使展开剂在缸中的深度至少1cm，加盖，混合均匀。数分钟后让溶剂在展开缸中饱和后，再将点好样的色谱板迅速入入缸内，昼不破坏缸内的气氛。薄层板下部浸入展开剂中约0.5cm 以上，但切不可让样品斑点浸入到展开剂中。由于吸附剂的毛细管作用，展开剂和斑点不断向上迁移，直到展开剂前沿到事先预定好的刻度线后（一个过程约25-30min），可取出色谱板。空气中晾干（约需要15min）。• 显色：在通风橱中，喷雾，在100o
C一烧烤10-20min。
作业：
拟定实验报告（长度2000字以上），分析部分包括：
计算果汁中所含糖的Rf。分析色谱过宽、颜色过深的原因。
实验四 植物单宁的提取测定
实验目的：
• 单宁是多
酚
类
化
合物 广义的多酚类化合物包括两大类，一类是非聚合物，如各种黄酮类化合物、绿原酸、鞣花酸等；另一类是单体酚类聚合而成的低聚体或多聚体，统称单宁类物质，或狭义的多酚类，包括水解单宁和缩合单宁两类。• 水解单宁：分子内具有酯键，通常以一个多元醇为核心，通过酯键与多个酚羧酸相连接而成。水解单宁在酸、碱、酶的作用下不稳定，易于水解。根据水解后产生多元酚羧酸的不同，水解单宁可分为琣单宁（水解后产生没食子酸）、鞣花单宁（水解后产生鞣花酸或其它与六羟基联苯二 酸有生源关系的物质。•
通过香草醛-盐酸法测定植物组织中缩合单宁含量，巩固从植物组织中分离生物分子的方法。
实验原理：
用70%甲醇溶液提取单宁，过滤，滤液加香草醛甲醇溶液和浓盐酸，显色后，以水为空白对照，用分光光度计于510nm处测定吸光度，用儿茶素作标准曲线测定单宁含量。
实验材料与仪器：
• 分光光度计
• 刻度移液管：1ml, 5ml, 10ml • 试管
• 容量瓶：volumetric flask 10ml, 50ml • 分析天平，感量0.0001g • 水浴锅water bath • 振荡机 • 移液管50ml •
具塞三角瓶100ml
实验步骤：
1.试剂配制： •
4%香草醛甲醇溶液：2g香草醛甲醇定容于50ml容量瓶中。
儿茶素标准溶液：5mg儿茶素标准品定溶于50ml容量瓶中。2.提取：
• 称取银杏/或柿叶10克，研磨，转移到三角瓶中，加70%甲醇溶液50ml，加塞子密封，于振荡机上振荡1小时，然后用双层
滤纸过滤，滤液备用。
3.测定： •
取0.5ml滤液，移入以铝铂遮光的试管中加入4%香草醛甲醇溶液3ml和浓盐酸1.5ml，在20o
C水浴中反应20分钟。蒸馏水作空白，510nm处测定吸光度。4．绘制标准曲线：
• 4.1 用移液管准确吸取0、1、2、3、4、5 ml儿茶素标准液，分别置于6个10ml容量瓶中，用70%甲醇溶液稀释至刻度（分别相当于0、10、20、30、40、50µg/ml的儿茶素含量）。
• 4.2 用移液管分别吸取以上儿茶素标准溶液系列0.5ml，置于6支铝铂遮光的试管中，各准确加入4%香草醛甲醇溶液3ml和浓盐酸1.5ml，在20o
C水浴中反应20分钟。蒸馏水作空白，510nm处测定吸光度。• 4.3 以吸光度值作纵坐标，儿茶素标准溶液系列中儿茶素含量（µg/ml）作横坐标，绘制标准曲线。•
5．计算：
• 单宁含量以样品中儿茶素质量的百分数表示，按下式计算： • 单宁含量（%）=50×V÷W • 50：提取液体积（ml）
• V：从标准曲线上查得的单宁含量（µg /ml）
• W：样品质量（µg）作业：
撰写实验报告（长度2000字）。
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