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我国人工组织工程角膜研究进展

摘要：角膜病患病率高,在致盲眼病中仅次于白内障。角膜移植术是治疗角膜盲的有效方法,也是角膜病患者改善视功能的主要手段。但角膜供体来源匮乏,不能满足角膜病患者的需要,组织工程技术的兴起和发展则为其开辟了新的治疗途径。应用组织工程技术构建三维角膜,旨在为角膜病及眼表疾病的临床治疗提供较好的材料来源,是目前眼科界研究的热点。

关键词： 构建组织工程;人工角膜;支架材料;种子细胞;角膜移植术;治疗;角膜盲

世界上 超 过 万 人 的 眼 盲 是 由角 膜 病 引起 ,胶原 材料，是 组 织 工 程 常 用 的天 然 蛋 白型胶原, 为导 致 眼盲 的第 二 大 原 因 仅 次 于 白 内 障[1] 穿 透性角膜 移植 术是 主 要 的 治疗 方 法，但 对 于 重 度 干 眼 症、重度化学烧伤等 的预后较 差 且 面 临 移 植 排 斥 供 体 不 足 等 问题。角膜的 应 用 和 组 织 工 程 角 膜 的研 究 为 角 膜 盲 患 者 带 来 了 希望，但 角膜 的构 建 材 料 依 然 是 限制 这 两 种 角 膜 发展 的重 要 因素。本文对材料和角膜材 料 的研 究 进 展 做 一 综 述。1 组 织 工 程 角膜 材料

功构建组 织 工 程 角膜个必备条件是种子细胞、支架材料和微 环境。生物材 料支架 常作 为机 械支 架 支 持 细 胞 生 长，减 轻 细 胞 反 应，并 随着 时 间 的 推 移 逐渐改变 它 们 的化 学 和 机 械 特 性。生 物相容性是其最重要的一个特性，生物材料越接近组织微环境，生物相容性越好[2]。理 想 的组 织 工 程 角 膜 材 料 应满足 以下条件。（1）生 物 相 容性 好，维持 三 维 空 间，促进正常细胞生 长和分化，不 干 扰 其 他 生 理 过 程（2）无 不 良组 织 反 应（3）材料制作简单 并 能按不 同的形状和大小重塑；（4）植 入 体 内后 材 料 可 被 降解 或吸收。1.1生物材料 1.11胶原在组织工程角膜材料中,胶原、羊膜、脱细胞角膜基质等生物材料的生物相容性较好,但可塑性欠佳;PGA等合成材料可塑性较好,但会产生酸性降解产物;将生物材料和合成材料复合,可以取长补短,成为组织工程角膜支架材料的研究方向之一。聚异丙基丙烯酰胺是一种新型合成材料,利用其温度依赖特性,不需酶消化即可获得完整的细胞层等特点,克服了组织工程角膜受到生物可降解支架限制的问题,具有良好的应用前景。人工角膜主要由中央光学镜柱和周边支架组成,Alpha or人工角膜多采用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)材料,Dohlman-Doane和Osteo-Odonto人工角膜包括陶瓷、聚四氟己烯、PMMA、PHEMA等材料,这些人工角膜已用于临床,但由于晚期并发症,目前仅适用于常规角膜移植失败的双眼混浊性失明患者[3]。组织工程角膜内皮载体材料的研究历程，总体上经历了从天然材料到人造材料，然后再回到天然材料这样一个循环，取得了宝贵的正反两方面经验。早期开始使用的材料主要有：异体角膜片、明胶薄膜、胶原凝胶、聚羟基乙酸和聚乳酸羟基乙酸、水凝胶膜等，而角膜基质，后弹力膜、羊膜基底膜、角膜基质片、复合生物膜是目前的研究热点。改善材料的亲细胞性、免疫原性和降解／溶解特性是今后的发展方向，并且应该加强对材料的人体效应和远期影响的研究[4]。1.1.2羊膜

羊膜在一百多年前就作为一种敷料应用于外科，上世纪初作为一种供体材料应用于外科皮肤移植手术中。1940年roth用羊膜修补损伤的结膜，由于术后出现挛缩和和融解，以致以后它在眼科的临床应用未能得到广泛的开展。kim和tseng在1995年把保存的羊膜运用于兔角膜重建术中并取得成功后，人们开始对羊膜的生物学特性有了一个全新的、深入的认识，羊膜越来越受到眼科工作者的青睐，在眼科的临床应用亦越来越广泛、成熟。1.1.3脱角膜基质

背景构建组织工程化角膜时，载体的选择十分重要。目前有多种载体可供选用，但脱细胞角膜基质是公认的较好载体。目的观察猪脱细胞角膜基质的组织结构特点，评价其与异种角膜基质和上皮细胞的生物相容性。方法取猪角膜组织进行组织块培养，经胰蛋白酶-EDTA酶消化角膜上皮、基质、内皮细胞，支架组织于-20℃冷冻干燥后灭菌保存。猪脱细胞角膜基质石蜡切片行常规苏木精一伊红染色，光学显微镜下观察组织的形态学特征；扫描电镜下观察其组织结构特点；并对其物理特性，如抗拉性、膨胀性、含水量和透明度进行评价。将猪脱细胞角膜基质移植到兔角膜基质层内，同时与体外培养的兔角膜上皮细胞共培养4周，分析其组织和细胞生物相容性。结果经酶消化处理后猪角膜组织中未见上皮、基质和内皮细胞，其胶原纤维直径大小、排列与正常角膜组织相同，抗拉性、膨胀性、含水量和透明度等物理特性与正常猪角膜相似[6]。1.14纤维蛋白

在凝血过程中，凝血酶切除血纤蛋白原中的血纤肽A和B而生成的单体蛋白质。易于平行交错聚集形成可溶性血纤蛋白多聚体，在凝血因子XⅢa作用下转变为不溶性血纤蛋白多聚体，形成血凝块[8]。是一类主要的不溶于水的蛋白质，通常都含有呈现相同二级结构的多肽链许多纤维蛋白结合紧密，并为单个细胞或整个生物体提供机械强度，起着保护或结构上的作用。2人工角膜材料

自法国眼科医师Pellier de Quinsy于1789年首先提出将玻璃片植入混浊角[5]膜以恢复视力以及Weber于1871年首次将一片水晶玻璃植入患者角膜，开创了人工角膜植入史以来，人工角膜的研究发展经历了200多年，经历探索、停滞、复苏和发展4个时期，无论在材料设计、制作工艺、手术技巧，还是术后处理都有新的发展。

人工角膜是用医用高分子材料制成的类似人体角膜的产品，人工角膜一般包括光学镜柱和周边支架两部分。光学镜柱是用光学特性优良、物理化学性质稳定的透明材料制成，用以替代病变后阻碍眼球光学通路的浑浊角膜；周边支架相当于连接光学镜柱和周边组织的桥梁，故而要求具有良好的组织相容性[9]。

甲壳素广泛存在于低等动物,特别是节肢动物的外壳、真菌及一些藻类细胞的细胞壁中,是一种天然的生物高分子多糖。甲壳素经过脱乙酰基反应成为壳聚糖,它是一种天然聚阳离子功能性生物多糖,具有优良的生物相容性,在体内可降解成为机体所需的氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖,在生物医用材料和组织工程方面得到较广泛研究和应用。角膜内皮细胞是位于角膜后部的单层细胞,前面与后弹力层相连,后面与房水相接触。角膜内皮细胞在维持正常角膜脱水状态、角膜厚度、透明度方面起着关键作用。目前,穿透性角膜移植术是取代病变或受损的内皮细胞恢复角膜透明性的唯一方法。但是供体来源的短缺、老年化及术后免疫排斥反应的发生,直接影响着角膜移植手术的开展和成败

。组织工程学是一门以细胞生物 3 学和材料学相结合,进行体外或体内构建组织或器官的新兴科学,利用组织工程方法体外构建人工角膜内皮是解决角膜内皮盲的有潜力的途径,而供内皮细胞生长的体外载体的研究成为组织工程角膜内皮研究的关键。目前供内皮细胞生长的体外载体报道最多的是同种异体或异种角膜的后弹力层(DM),由于后弹力层上有层粘连蛋白(LN)存在,而层粘连蛋白(LN)在内皮细胞贴壁的过程中起着重要作用,因此后弹力层是内皮细胞的最佳底物。除了DM外,报道的载体尚有可生物降解的聚合物PLLA和PLGA、水凝胶膜、胶原膜、明胶薄膜以及羊膜等。但上述载体各有缺点,距离临床有较大距离,而且没有以多糖为主要材料的角膜内皮载体见到报道。本实验选择甲壳素及其衍生物为基本材料,通过与其他多糖的共混,制备出适合角膜内皮细胞生长的膜片,以期解决角膜内皮缺损的问题。

.角膜设计中，较为成功的是Alpha or、Dolman-Doan和Osteo-Odonto，并获得了FDA 批准，进入临床阶段。

2.1 Alpha or人工角膜

20世纪90年代初期，澳大利亚Lion眼科研究所的Charlie等[13]将PHEMA水凝胶制作了一体式人工角膜Alpha or，又称为“Charlie”角膜，并在1998-02首次进行人体试验。随后，世界各地的 临床试验陆续展开，该种角膜成为 临床使用最为广泛的角膜。Alpha or具有海绵状结构的支架和光学镜柱，两部分由含水量不同的PHEMA水凝胶组成，互穿网络结构连接，能够承受较高压力和拉力。由于镜柱与周边支架都是采用同一种材料(PHEMA水凝胶)，物理与化学性质相似，解决了两部分的结合问题，同时也减少了结合部位发生细菌感染的概率,但发现有钙或色素沉积[11]。

2.2 Dohlman-Doane人工角膜

Dohlman-Doane人工角膜为领一扣式，全部由PMMA构成，包括前盘、主干及后盘。I型主要用于泪液充足、能维持眼表湿润的患者。II型多一个前柱，突出于眼睑，用于终末期干眼患者。该人工角膜预后因术前诊断及眼表炎症程度而不同，由于免疫排斥多次移植失败且术前无严重炎症者预后最好，而Stevens-Johnson综合症等预后较差。

2.3 Osteo-Odonto人工角膜

Osteo-Odonto人工角膜是最早、也是最成功的人工角膜，由意大利科学家Trample首创，利用自体组织(牙齿)作为周边支架，PMMA作为光学镜柱，这种骨齿型特殊结构对于增加角膜耐受性，更好的与宿主结合，起到积极作用。由于术式复杂，创伤较大，因此仅在无其他办法时使用这种人工角膜。该人工角膜相对其他人工角膜的长期保留率高，有学者报道18年保留率达85%，75%的患者视力达6/12或更好该人工角膜的主要问题在于术后视野受限、青光眼、骨齿板层溶解、无法测量眼内压等并发症。

其他人工角膜还有BIOKOP人工角膜、Seoul-type工角膜、Cardona工角膜、MICOF工角膜等[13]。

近年来，“镜柱-支架”型由于具有黏合困难，结合部强度较差，房水渗漏等缺点，很多科学家又将目光投向了传统的“一体式”结构。近日，美国科学家利用新型复合水凝胶Dumpty，制作了一款一体式人工角膜，目前正在进行动物试验，表现良好。

角膜组织工程项目的巨大成功是我国独立自主的知识产权，为我国占据组织工程角膜生产及其临床应用的国际制高点创造了极其有利的条件。樊廷俊进步指出，工程角膜内皮以及人工全角膜的产业化，可以用于角膜内皮盲、角膜盲以及各种角膜疾病的角膜移植和治疗，使广大角膜盲患者重见光明。我国现有角膜盲患者500余万人及白内障患者500余万人，而且还在逐年增加。作为目前角膜内皮盲、角膜盲临床移植治疗唯一替代物的工程角膜内皮及人工全角膜，用于各种角膜内皮盲、角膜盲的临床角膜移植和治疗已成为可能。这不仅可以使量众的上述各种角膜盲患者重见光明，还能解除因患者失明而给家庭带来的精神和生活压力。角膜组织工程项目所生产的工程角膜内皮与工程全角膜，在帮助患者解除病痛困扰的同时，产生的经济效益也是相当可观的。就工程角膜内皮而言，以患者的移植覆盖率按70%估算，国内可创造直接经济效益400亿～600亿元、全球3000亿～4000亿元；就工程全角膜而言，以患者的移植覆盖率按70%估算，国内、国外产生的直接经济效益分别为400亿～500亿元、4000亿～6000亿元。

目前已有多种人工角膜应用于临床，但其材料均达不到理想要求，且由于人工角膜的晚期并发症：角膜溶解、植人物排出、房水渗漏、眼内炎、人工角膜后增生膜、青光眼等，目前仅适用于常规角膜移植失败的双眼角膜混浊性失明患者，一般只作为最后的选择。理想人工角膜应具有以下特点：①优良的光学特性，稳 5 定的物理化学性[14]质。② 能够与自体角膜组织长期共存，并紧密结合。③无不良反应，并发症少。④手术简单，制作容易，经济实惠。

今后，人工角膜的研究重点是集中生物材料学、细胞生物学、分子生物学及临床医学专家联合攻关，选择真正生物相容性材料，改善光学镜柱和周边支架的整合，更重要的是周边支架和受体组织的整合。3理想的人工角膜及前景展望

角膜病是全世界第二致盲眼病,仅次于白内障,据估计已经影响到1～1.5亿人口[8].尽管一些人工角膜已经应用于临床,在某种程度上缓解了角膜供体短缺的现状,但手术适应证的局限性以及术后严重的并发症都给患者带来了治疗的障碍和高风险.目前,组织工程化人工角膜领域取得了突飞猛进的发展：在克服了生物相容性、机械稳定性、光学透明性的挑战后,神经的再生使得组织工程化人工角膜在生理学方面更接近于人角膜.此文着重介绍了研究者不断完善组织工程化人工角膜的方法：体外细胞的培养、细胞外基质的建立、促进多聚体和细胞相互作用的修饰以及神经功能的恢复.参考文献：

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