甘油含量测定_甘油含量的测定
甘油含量测定由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“甘油含量的测定”。
嗯。你都问到这个问题了，具体仪器、操作什么的我就不说了。就说一下思路。
强碱条件下甘油和二价铜的络合物显绛蓝色，所以利用甘油的这个特性就可以轻松搞定。
主要试剂是AR级的甘油、氢氧化钠、硫酸铜。
向氢氧化钠碱化的甘油溶液里加硫酸铜，一定要保证甘油被完全络合，并且保证多余的二价铜都以氢氧化铜沉淀形式存在，但是氢氧化钠也不要加太多。
甘油铜可见区最大吸收波长是在630nm。
先作个标准系列，绘出吸光度-浓度曲线，然后把待测试样吸光度测出来在标准曲线上一算，浓度就得到了。
氢氧化铜解离出来的铜离子在630nm处也有吸收，好在它是一个定值，测出来后从每个甘油的A里面扣掉就行了。
甘油含量化学方法有很多，比色法，滴定法．甘油在强碱性条件下，与Cu2+定量形成绛蓝色的甘油铜溶液。根据朗伯-比尔定律，溶液吸光度A与吸光物质浓度C成正比：A=kC。甘油配制浓度C1与衍生的分析甘油铜浓度C有如下关系：C=k1C1，k1为稀释系数，则吸光度值与甘油配制浓度有如下正比关系： A=kk1C1+ε，k、k1为常数，ε为系统误差。
先根据吸光度与甘油配制浓度C1做出关系曲线:，然后确定最佳线性拟合范围，最终得出拟合线性方程，程序化后，用于甘油含量的快速测定。
[供应] 拜发甘油检测试剂盒
发布日期：2010-9-21
截止日期：2009-5-9
拜发甘油检测试剂盒（酶学试剂盒）订货号： 10148270035 产品名称： 甘油（Glycerol）产品英文名称： Glycerol 包装： Ca.3 x 11 tests 产品介绍： 如下
产品说明： Glycerol（用于检测食品中的甘油）
酶法分析试剂盒（紫外分光光度法）
RIDASCREEN（产品编号：0 414 433）30次检测
1.简介
酶法分析试剂盒（紫外分光光度法）此法适用于检测食品（啤酒、葡萄汁、醋、蜂蜜、酒精、果酒）、化妆品、药品（溶液、栓剂）、纸板、烟草及生物制品中的甘油。2.原理
甘油在甘油激酶的催化下可被ATP磷酸化为3-磷酸甘油酯，ATP转化为ADP； 反应式为 GK Glycerol﹢ATP L-glycerol-3-phosphate﹢ADP 上式中形成的ADP在丙酮酸激酶的催化下可与PEP作用下生成ATP及丙酮酸酯； 反应式为 PK ADP﹢PEP ATP﹢Pyruvate 丙酮酸酯在L-乳酸酯脱氢酶的作用下可被NADH还原为L-乳酸酯，NADH被氧化为NAD； 反应式为 L-LDH Pyruvate﹢NADH﹢H﹢ L-lactate﹢NAD﹢
被氧化的NADH的量取决于甘油的量，NADH的吸光度值可在334，340及365nm下测量。3.试剂盒内容物
－－－－瓶1共有3瓶，每瓶约有2g辅酶及缓冲液的混和物，包括：甘氨酰甘氨酸缓冲液，PH约7.4； NADH约7mg；ATP约22mg；PEP-CHA约11mg；硫酸镁 －－－－瓶2约0.4ml悬浮物，包括：
丙酮酸激酶，约240U； L-乳酸酯脱氢酶，约220U －－－－瓶3约0.4ml甘油激酶悬浮物，约34U －－－－瓶4为甘油检测对照溶液（甘油检测对照溶液可不需要计算结果），此溶液使用时不需稀释。（效期见标签）
4.检测溶液的制备（10次）
－－－－取出1瓶瓶1，用11ml重蒸水溶解，使用时此溶液需在20-25℃持续回温约10分钟 －－－－瓶 2不需稀释 －－－－瓶 3不需稀释 5.操作者应该注意之事项
使用前请仔细阅读，中文翻译件仅供参考
－－－－瓶1约含500mg碳酸钠，应避免接触皮肤和呼吸器官，其他用于甘油检测的试剂不具有危险性 －－－－实验之后，用过的试剂可作为实验室废料处理，但必须在当地法规允许的前提下 6.储存条件
－－－－瓶 1在2-8℃下保存（见标签），溶液1在2-8℃下可保存4天，溶液1使用前需回温至20-25℃
－－－－瓶2及3在2-8℃下保存（见标签）7.样品处理
－－－－直接取用无色，透明，中性的溶液或按稀释表格稀释后进行检测，体积为2.000ml －－－－过滤混浊溶液
－－－－除去样品溶液中的二氧化碳气体
－－－－加入氢氧化钠或氢氧化钾来调节酸溶液的PH值约为8 －－－－对于深颜色的样品溶液可不需稀释或者用PVPP或酰胺配成较高浓度的溶液如：1g/100ml －－－－粉碎或均质固体和半固体样品，用水抽提或溶解，而后过滤，通过Carrez澄清液可脱去其中的混浊物或色素
－－－－用Carrez试剂可脱去样品中的蛋白质
－－－－用热水抽提样品中的脂肪（抽提温度需在脂肪的溶解度之上），冷却后可分离出脂肪，将余下物质转移至容量瓶中并加水至刻度，冰浴15分钟而后过滤，热水抽提后用Carrez溶液澄清 8.过程
1.波长：340nm，Hg365nm或Hg334nm 2.比色杯：光径1.0cm 3.温度：20-25℃ 4.最终体积：3.020ml 5.对照空气（光路上无比色杯）或对照水读取读数
6.样品溶液：1-40ug甘油/检测（体积为0.100-2.000ml样品体积）7.具体操作见如下表格 移液 空白（ml）样品（ml）溶液1 样品溶液 重蒸水 悬浮物2 1.0001﹢9 1﹢99 1﹢999 1 10 100 1000 如果测得的吸光度值△A较低，例如低于0.100，则样品溶液需重新配制，可由下列几种解决方法 1.可多称出些样品或不要过分稀释。
2.加入到比色杯中的溶液体积可增加至2.000ml，当然为了得到相同的最终体积（样品和空白），加入的水的体积就要相应减少。所加入的新溶液的体积在计算时是要考虑进去的。11.技术信息
加入悬浮物2（PK/L-LDH）后等待前反应进行完全后是非常必要的。12.特性
此法特异性适于甘油的检测。13.灵敏度和检测限
1.最小的吸光分辨率为0.005个吸光单位，相应的最大样品体积为2.000ml，340nm下测量，则样品的甘油浓度为0.1mg/L；若样品体积为0.100ml，则样品的甘油浓度为2mg/L。
2.340nm下，吸光度值差为0.020可导出检测限为0.4mg/L，相应的最大体积为2.000ml。14.线性
从1ug甘油/检品（0.4mg甘油 /L样品溶液，样品溶液V=2.000ml）到40ug甘油/检品（0.4g甘油/L样品溶液，样品V=0.100ml）15.精确性
用同一样品溶液做平行测定时，其吸光度值差会有0.005至0.010的差异，样品体积为0.100ml，340nm下测量，相应的甘油浓度约为2-5mg/L；若样品是经过稀释的，则在计算结果时需乘以稀释倍数。16.干扰信息来源
ATP和PEP的缓慢水解同NADH的缓慢氧化均可导致缓慢的蠕变反应；空白和样品的吸光度值可不必逐一立即检测。
17.检测过程中的干扰
1.根据过程中所给定的时间甘油若能转化完全，则可断定没有干扰发生。
2.反应结束后，可加入一些甘油重新检测（定性或定量）：如果加入标准物质后，吸光度值会随之改变，则可断定没有干扰发生。
3.操作过程中的错误和干扰可通过两个样品体积的平行实验测得（如0.100ml和0.200ml）：测得的吸光度值差应与样品体积成比例关系。
当测定固体样品时，可称取不同质量（如1g和2g）于同一100ml容量瓶中，测得的吸光度值差及样品的质量应与样品的体积成比例关系。
4.样品所含物质带来的可能干扰可通过加入内标来控制：除去样品、空白及标准的检测外，样品加检测对照溶液也要检测的，测得的吸光度值差可计算干扰。
5.通过回收试验可测定可能的损失：分别测定加入标准与不加入标准的样品，在误差范围之内可定量测定附加物。
18.Carrez试剂的澄清作用
－－－－移取液体样品于盛有60ml重蒸水的100ml容量瓶中或称取足够重量的样品于100ml容量瓶中 －－－－加入60ml重蒸水
－－－－仔细加入5mlCarrez-Ⅰ-溶液（85mM，3.60gK4Fe（CN）6*3H2O/100ml）和5ml Carrez-Ⅱ-溶液（250mM，7.20gZNSO4*7H2O/100ml）
－－－－用氢氧化钠调节溶液PH于7.5-8.5，加入每一溶液后需充分混和，加水至容量瓶刻度，混和并过滤
19.应用举例 1.果汁中甘油的检测 －－－－稀释样品其浓度约在0.4g/L以下（见稀释表格）－－－－过滤混浊果汁，取用透明或淡色溶液用于检测 当分析深色果汁时（如：草莓汁和红葡萄汁）需要先脱色 具体操作
－－－－在10ml果汁中加入0.1g酰胺粉末或PVPP －－－－搅拌1分钟后过滤
－－－－取透明溶液用于检测，该溶液可带有轻微颜色 2.酒中甘油的检测
－－－－根据稀释表格将样品进行稀释 －－－－实际上红酒不需脱色也可进行检测 3.啤酒中甘油的检测
－－－－取5-10ml啤酒用玻璃棒搅拌约1分钟，除去其中的二氧化碳气体 －－－－根据稀释表格稀释脱去二氧化碳气体后的样品 4.烟草制品中甘油的检测 －－－－充分混合并绞碎样品
－－－－精确称取1g样品于100ml容量瓶中
－－－－加入约70mL水磁力搅拌约1小时20-25℃下，而后加水至刻度，混和并过滤 －－－－移取25ml滤液于50ml容量瓶中
－－－－加入5mlCarrez-Ⅰ-溶液，5ml Carrez-Ⅱ-溶液及10ml氢氧化钠溶液，在加入每一溶液后均需充人混和
－－－－加水至刻度混和并过滤，取滤液用于检（0.100ml-0.500ml）5.化妆品中甘油的检测
6.发酵产品及生物培养基中甘油的检测
－－－－置样品（可先经过离心）于80℃水浴中15分钟以停止酶的反应 －－－－离心并取上层溶液（可根据稀释表格稀释）用于检测 －－－－另外可用高氯酸或Carrez溶液脱除蛋白质 琼脂培养基需先均质，而后按以上方法进行操作。
名称：甘油检测试剂盒 编号：EK-GCROL 货号：100001001 Cas No：70
购买：
Glycerol Aay Kit(70 次测定)简介: 甘油是一种非常重要的物质，广泛的应用于工业生产中，在食品工业中，常被作为保湿剂、增香剂和增色剂等使用，以改良食品的质量。甘油是酿酒酵母发酵过程中的副产物,也是灰质葡萄孢新陈代谢过程中的一个重要产物，甘油是高品质果酒的一个成分，高品质的葡萄汁中不含有(或只含有痕量或微量)甘油，浓度大约为1%(v/v)，若葡萄汁中含有甘油则意味着产品中使用了品质不好的原料。甘油也常常作为润滑剂用在洗涤液、乳酪和牙膏中，在制烟工业中，通过通常是预先向烟叶上喷洒甘油以保障不会粉碎的目的。
原理: 甘油在甘油激酶(GK)的作用下被磷酸化，消耗ATP转化成L-3磷酸甘油（L-glycerol-3-phosphate）。
(1)Glycerol + ATP(GK)L-glycerol-3-phosphate + ADP
上式中形成的ADP在丙酮酸激酶(PK)的催化下可与PEP作用，生成ATP及丙酮酸酯
(2)ADP + PEP(PK)ATP + pyruvate
丙酮酸酯在L-乳酸酯脱氢酶(L-LDH)的作用下可被NADH还原为L-乳酸酯，NADH被氧化为NAD
(3)Pyruvate + NADH + H+(L-LDH)L-lactate + NAD+
被氧化的NADH的量取决于甘油的量，NADH的吸光度值可在340下测量。
特异性, 灵敏度, 测量范围和精确度: 该实验方法是专门用于测定甘油含量的，对于纯甘油（水中的游离甘油）几乎可以100%检测到。最小可调吸光光度为0.010个吸光单位，样品体积为2.00 mL，若在340nm下检测,此时的甘油浓度为0.171 mg/L。如果最小可调吸光光度为0.020吸光光度，样品体积为2.00 mL，在340nm下检测,此时的甘油检测线为0.342 mg/L。
该实验的测量范围为0.8ug-35ug甘油，同一样品分别进行两次测定，其吸光度值会有0.005-0.010吸光单位的变化，对于样品体积为2.00 mL，此时的甘油浓度大约在0.086-0.171 mg/L之间，如果样品是经过稀释的，在计算结果时候需要乘以相应的稀释系数（F）,如果在样品制备阶段，样品的重量是被称量的，如：10g/L,0.02-0.05g/100g的细微差别能够被分辨。
干扰: 如果甘油在试验规定的时间内（大约5分钟）完成转化过程，通常认为没有干扰发生，然而，通过向已完成反应的试管中添加甘油（0.1mL中添加20ug），进一步的实验表明，吸光度值还会进一步降低。利用附带的内部的标准质控可以对干扰物质进行鉴定。定量回收试验：通过向样品中添加标准质控，计算样品在处理和提取时的损失。如：在最初的提取步骤时添加一定量的甘油。
安全性: 甘油测定所使用的试剂没有有毒物质。然而浓缩缓冲液中含有作为防腐剂用的叠氮化钠(0.02 % w/v)，需要按照实验室安全操作规程进行试验。
试剂盒: Megazyme甘油含量测定试剂盒可以进行70次的测定试验，并提供有全部的试验方法：
瓶1: Tris/HCl 缓冲液(30 mL, 1.0 M, pH 7.4)+氯化镁(30 mM)+叠氮化钠(0.02 % w/v)稳定性> 2年，4°C保存。瓶2: 药片(14个)含有NADH+ATP +PEP 稳定性> 2年，4°C保存。
瓶3: 丙酮酸激酶(600 U/mL)+L-乳酸酯脱氢酶(550 U/mL)悬浮液1.5mL 稳定性> 2年，4°C保存。
瓶4: 甘油激酶悬浮液(1.5 mL, 85 U/mL)稳定性> 2年，4°C保存。
瓶5: 甘油质控标准液(5 mL, 0.20 mg/mL)+ 0.02 %(w/v)叠氮化钠 稳定性> 2年，4°C保存。
试剂制备: 1.使用瓶1作为稀释液。
2.1.1 mL Tris/HCl缓冲液溶解瓶2中1片药片，大约1-2分钟，足够进行5次试验。一旦药片溶解，NADH吸光度会随着时间的延长而降低，不过溶解的药片保存在4°C下大约可以使用4天，或保存于-20°C下大约可以使用4周的时间。
注意: 在打开瓶子前，首先需要将瓶子中的药片恢复到室温，避免潮气可能吸附到药片上，而影响药片的稳定性。& 4.准备瓶3和瓶4种的溶液，第一次打开前，需要充分晃动瓶子，不要让酶吸附在橡皮塞上，然后垂直存放好瓶子。每次使用前还需要充分混合其中的内溶物。5.准备瓶5溶液。
注意:当您怀疑分光光度计的准确性或怀疑样品中的物质抑制了试验，再使用甘油标准质控溶液进行测定，通过测量NADH的消光系数而计算甘油的浓度。
实验需要的设备: 1.容量瓶(50 mL, 100 mL和500 mL).2.比色杯(1 cm, 3.0 mL).3.微量移液器 4.连续分配器 5.分析天平
6.分光光度计 340 nm.7.漩涡混合器 8.定时钟
9.Whatman No.1(9 cm)滤纸
操作步骤: 波长: 340 nm 比色杯: 1 cm light path(玻璃或塑料)温度: 25°C 最终体积: 2.34 mL 样品溶液: 每个比色杯中含有0.8-35ug甘油（存在于0.10-2.0 mL样品溶液中）空白调 0：相对于空气或者水 溶液 空白管 样品管 蒸馏水(~ 25°C)样品
溶液2(NADH/ATP/PEP/Tris/HCl)悬浮液3(PK/L-LDH)2.10 mL — 0.20 mL 0.02 mL 2.00 mL 0.10 mL 0.20 mL 0.02 mL 混合*，在反应大约4分钟后读取溶液(A1)的吸光度值（前反应完成**），在添加下列试剂后继续进行试验 悬浮液4(GK)0.02 mL 0.02 mL 混合*，在停止反应后（大约5分钟）读取溶液(A2)的吸光度值，如果反应没停止，在间隔2分钟后，再次测量，直到最终的吸光度值不再变化。
* 用塑料棒搅拌或用试管塞封闭严实后轻轻颠倒 ** 必须在等到前反应完成后再添加悬浮液3(PK/L-LDH)计算: 分别对空白管和样品管两次测得的吸光度值进行相减(A1-A2)，这样就获得了ΔAglycerol，按照常规ΔAglycerol 的数值至少要在0.100个吸光单位，才能获得满意的试验结果。
甘油的含量可以依照下列公式计算:
C = V x MW x ΔAglycerol [g/L] εx d x v
注释: V = 最终体积 [mL] MW = 甘油分子量 [g/mol] ε = NADH在340 nm下的消光系数 = 6300 [l x mol-1 x cm-1] d = 比色管管径 [cm] v = 样品体积 [mL]
简化公式:
C = 2.34 x 92.1 x ΔAglycerol [g/L] 6300 x 1 x 0.10 = 0.3421 x ΔAglycerol [g/L]
如果样品在制备过程中被稀释了，计算结果还必须乘以稀释系数F。
当被分析的物质为固体或半固体时，甘油含量(g/100 g)依照下列公式计算： 甘油含量
= C甘油 [g/L 样品溶液] x 100 [g/100 g] 样品重量 [g/L 样品溶液]
注意: 使用Mega-CalcTM，该计算方法可以被简化。
制备样品: 1.稀释样品.比色杯中（如：分析0.1 mL的样品）的甘油总含量必须在0.8-25ug之间，因此样品溶液必须被充分的稀释到浓度在0.008-0.35 g/L之间。估计浓度(g/L)蒸馏水稀释 稀释系数F 35 不用稀释 1 + 9 1 + 99 1 + 999 1 10 100 1000
如果ΔAglycerol 的数值太低(如
Carrez II溶液： 溶解7.20 g硫酸锌(ZnSO4.7H2O)(Sigma cat.no.Z-4750)到100 mL的蒸馏水中，室温保存。
氢氧化钠(NaOH, 100 mM)：溶解4 g NaOH到1 mL的蒸馏水中，室温保存。
b.步骤: 吸取液体样品到含有大约60 mL蒸馏水的100 mL容量瓶中，或称取足够量的样品到含有大约60 mL蒸馏水的100 mL容量瓶中，缓慢的加入5mL Carrez I 溶液和10mL NaOH溶液(100 mM)，然后充分混合，补液至刻度线，混合并过滤。3.总则.(a)液体样品: 清澈的或稍有些颜色的，pH大约为中性的液体样品可以直接检测。
(b)酸性样品: 如果样品为> 0.1 mL的未被稀释的酸性样品（如葡萄酒或果汁），必须用2 M NaOH调节pH到大约7.4，然后在室温中孵育30分钟。
(c)含二氧化碳样品: 样品中含有大量的二氧化碳，如：啤酒，必须用2 M NaOH调节pH到大约7.4，并缓慢的用玻璃棒搅拌。
(d)有颜色的样品: 测试中附加样品空白，如：样品中不含有GK，在这种情况下，样品必须附加样品空白。(e)重颜色的样品: 如果未经稀释的样品颜色非常深，需要向每10mL的样品中加入0.2g聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP），充分混合5分钟，然后用Whatman No.1滤纸过滤。(f)固体样品: 均质或粉碎固体样品，然后加入到蒸馏水中，并过滤。
(g)样品含有脂肪: 需要用超过脂肪沸点的水进行提取，如：将100mL容量瓶加热到60°C，然后恢复至室温，并补液至刻度线，放置冷藏箱中15-30分钟，过滤，弃去最初的几mL滤液，选择澄清的或稍有些乳白色的悬浮液进行测试。也可以选择使用Carrez 溶液进行澄清。(h)样品中含有蛋白: 使用Carrez 溶液去除样品中的蛋白。
样品处理事例:(a)测定葡萄酒中的甘油.通常情况下，测定白/红葡萄酒中的甘油含量都不需要对样品进行处理，只需要依照稀释表格进行稀释即可。如：按照1:20倍稀释0.1mL的样品。
(b)测定啤酒中的甘油含量.使用玻璃棒进行充分的搅拌，去除样品中的二氧化碳，然后进行稀释即可测定。如：按照1:5倍稀释0.1mL的样品。
(c)测定果汁和相关饮料中的甘油含量
稀释样品中的甘油含量至少到0.35 g/L，澄清的、中性的样液可以直接进行测试，不需要进行特殊处理。浑浊的液体稀释前首先需要进行过滤。
有颜色的样品溶液通常在稀释到适当的甘油浓度即可测定。然而，如果要测定不经稀释的样品液中的甘油浓度，需要依照下列步骤进行脱色：
用1 M NaOH调节25mL样品溶液的pH大约至7.4，然后用蒸馏水补液至50 mL，加入0.5g PVPP，充分搅拌5分钟，然后用Whatman No.1滤纸过滤。使用澄清的或稍有些颜色的提取液进行测试。没有必要进一步稀释，可以直接进行测定。
(d)测定烟草制品中的甘油含量.将样品粉碎成大约0.2 mm的小颗粒，准确的称量1g样品，放入到100 mL容量瓶中，加入大约60 mL蒸馏水，用磁力搅拌器在20-25°C下充分搅拌1小时，然后用蒸馏水补液至刻度线，混合并过滤。移取25 mL滤液到50mL容量瓶中，继续加入5 mL Carrez I 溶液、5 mL Carrez II 溶液和10 mL NaOH溶液(100 mM)，每加一种溶液都要充分混合，然后补液至刻度线，混合并用Whatman GF/A玻璃纤维滤纸过滤，没有必要进一步稀释，可以直接进行测定。
(e)测定肥皂中的甘油含量.准确称取1 g粉碎的肥皂粉末，加入50mL 0.1M HCl，用热磁力搅拌器充分搅拌至沸腾，将溶液转移至100 mL容量瓶中，然后添加30mL 0.1M HCl继续搅拌提取，待温度降至20-25°C后用蒸馏水补液至刻度线，将容量瓶放置于冷藏室15分钟，用Whatman GF/A玻璃纤维滤纸过滤，取25 mL滤液，加入2 mL 2 M Tris/HCl 缓冲液（pH 7.4，自备），用1M NaOH调解pH大约至7.4，补液至50 mL，直接对该溶液（或进一步稀释）进行测定。
(f)测定牙膏中的甘油含量.准确称取1 g牙膏样品，加入70 mL蒸馏水，在70°C下充分搅拌30分钟，然后离心(~ 3,000g 10分钟)，再次洗涤悬浮液中的小球2次—加入50 mL蒸馏水，重复搅拌和离心步骤，补液至250 mL并过滤，可以按照1:3倍稀释0.1 mL滤液，进行测定。
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