霉菌的基因工程技术_链霉菌基因工程

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霉菌的基因工程技术

课程：食品生物技术 专业： 班级： 学号： 姓名：

完成时间：2011 年5月26日

霉菌的基因工程技术

摘要：霉菌在自然界中分布广泛，与人们的日常生活极为密切。自从弗莱明发现青霉素以来，国内外对霉菌的研究引起众多学者的关注，本文对目前霉菌的应用现状作一综述，并介绍了利用基因工程改良霉菌菌种常用的几种方法。

关键词：霉菌 基因工程 菌种改良 应用

0前言

霉菌是能引起物种霉变的丝状真菌的统称，是真菌的一部分。凡是生长在培养基上呈绒毛状、蜘蛛网状或絮状菌丝体的菌落，都称之为霉菌。霉菌在自然界中分布非常广泛，与人们的日常生活极为密切，用途很多，如用于传统的酿酒、制酱和制作副食品及其他的发酵食品，并可从中提取药物、色素等。总之霉菌在农业、纺织、食品、医药、皮革及促进自然界的物质循环等方面都起着极为重要的作用。当然它对人类也有有害的方面，如可使人、畜、农作物患病，使食品、纺织品霉变等。1霉菌的应用 1.1抗生素

抗生素是微生物在代谢过程中产生的能选择性地抑制其它种微生物生长和活动，甚至杀灭它种微生物的生物活性物质。随着青霉素的发现和由此研制而成的多种抗生素使人类得以治愈传染病、有效地控制传染病的流行。除了青霉素，还有许多抗生素来源于霉菌，例如灰黄霉素、头孢霉素等。1.2 生物农药

自然界中有很多生物合成的天然物质具有农药功能，提取其有效成分加工为农药应用,这是制取生物农药的主要途径。目前包括我国在内的许多国家还大量应用化学农药，已普遍导致了对环境的污染，致使农产品安全卫生问题严重，品种下降，并频繁危及人类身体健康。生物农药有以下几个优点:能有效的控制害虫，不杀伤天敌，不破坏生态平衡，不污染环境，因而有广阔的开发前景。目前从霉菌着手寻找生物农药的研究也很深入广泛，例如：木霉菌是一类具有广谱性、拮抗性生物防治菌。1.3天然色素

食品及化妆品生产领域中都离不开色素，但多使用化学合成色素，其毒性问题已逐步引起人们的关注，国内外在其用量及使用范围方面均有限制。从生物中提取的天然食用色素无毒性，食用安全性好，但大多数因原料来源少，价格高限制了其广泛应

用。目前用霉菌生产色素的例子也很多，例如:红曲霉菌，是用于提取色素最多的霉菌，中国利用红曲已有上千年的历史，用于红腐乳、酒类和其他食品中。1.4抗肿瘤

在霉菌发酵产物中还发现有能抑制缺氧信号传递的小分子物质，很多类型的人类肿瘤细胞都处在严重缺氧的状态下，它们为了生存，建立了一系列的级联反应来缓解缺氧。Pladienolides是一类由普拉特链霉菌 Mer2 11107发酵产生的大环内酯类抗生素，可抑制肿瘤细胞生长和缺氧信号传递，它在小鼠异种皮移植入肿瘤的模型中表现出了强大的抗肿瘤效果。可见它有望成为新型的抗肿瘤药物。1.5具有特殊活性的酶

木霉菌能产生纤维素酶，它可直接作用于纤维素使其断裂分解为低分子的化合物及葡萄糖等被动物所利用，另一方面，纤维素酶可使粗纤维素分解从而可使更多的植物细胞内容物分离出来，提高了这些营养物质的消化率。此外，木霉菌还可产生半纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、果胶酶，这些酶的共同作用可提高对碳水化合物、蛋白质和矿物质的消化吸收率，促进吸收[1]。1.6食品发酵

腐乳是我国独特的传统发酵食品之一，系用豆腐坯经毛霉菌培养酿制而成。毛霉菌种的质量好坏关系到腐乳的形状、色泽滋味及理化质量，目前经过菌种选育，已获得一株生长快速、菌丝旺盛、蛋白酶活性强的毛霉菌株，用它制成的接种剂可用于腐乳和腊八生产，其产品质量优良、稳定[2]。此外，常用于腐乳的霉菌还有黑根霉、米曲霉、红曲霉等[3]。2基因工程

2.1基因工程的涵义

用酶学方法，将异源基因与载体DNA在体外进行重组，将形成的重组子DNA导入宿体细胞，使异源基因在宿体细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类所需要的生物品种和产物。[4]2.2基因工程操作的主要步骤：

（1）采用cDNA文库人工合成或PCR扩增，分离制取目的基因片段（2）采用核酸限制性内切酶Ⅱ同时剪切目的基因和克隆载体

（3）在T1DNA连接酶的作用下将目的基因与基因载体连接而成重组DNA（4）把重组DNA分子导入受体细胞，并在一起扩增而成克隆子（5）标记分析和筛选出获得重组DNA分子的克隆受体细胞

（6）进一步了扩增、转化、表达，最终生成新的优良性状的菌种或人类所需要的产品

2.3基因工程的工具酶

酶在基因工程操作中是不可缺少的工具，在基因工程中应用的酶统称为工具酶。要取得所需的目的基因DNA并与载体DNA连接在一起形成DNA重组体，首先要提供限制性内切酶和DNA连接酶。此外，还有其他工具酶，如T1多聚核苷酸激酶、碱性磷酸酯酶、核酸酶S1、反向转录酶和末端脱氧核苷酸转移酶等。到目前为止，常用的工具酶已有3000多种。2.4基因工程的载体

目前，在基因工程中应用的基因载体主要是质粒、病毒和噬菌体。载体的具备以下几个性能：

（1）分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。

（2）能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。

（3）要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点。（4）有适合的标记，易于选择。

（5）有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。

（6）从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。3霉菌的基因工程改良 3.1目的基因的制备

3.1.1限制酶法 用限制性内切酶消化含有目的基因的外源，使其获得目的基因,并使之产生粘性或平头末端 ,以与载体连接。限制酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型,常用的为Ⅱ型酶 ,因为它有特异性识别位点 ,切口有规律 ,只要有镁离子即可激活,且效率极高。

3.1.2cDNA法 由于真核生物的基因中含有非编码间隔区 ,在原核生物中无法正常表达 ,必须除去内含子。mRNA是经转 录加工过 的RNA,无内含子 ,在反转录酶下,以mRNA为模板合成出互补DNA再加上接头,即可与载体连接。

3.1.3 PCR扩增技术实际是体外DNA合成放大技术。其基本原理是依据细胞分裂中DNA合成半保留机制，及在体外DNA分子于同温度下双链和单链可以互相转变的性质 ,人为控制体外合成系统的温度,使双链变成单链。单链DNA和人工引物退火。以

及在dNTP存在下 ,耐高温的DNA 聚合酶使引物沿单链模板延升双链DNA高温变性,低温退火,适温延升等三步循环使DNA 扩增。

3.1.4鸟枪法 鸟枪法实质上是采用基因工程手段把染色体DNA用限制性内切酶切割，将所有的片段都连接到某种载体上，转入大肠杆菌中增值。再用适当方法来筛选含该基因的重组体菌落，从重组体细菌提取DNA，经酶切后即可制取该基因。对真核细胞基因，因酶切后形成大小不等的成千上万DNA片段，若采用此法则难于筛选出所需要的基因。因此，可采用凝胶电泳、密度梯度离心法或液相层析等方法。先把DNA片段按大小分成几个组，然后，在采用鸟枪法分离目的基因。

3.2选择适当的载体 载体是用于传递外源DNA序列进人宿主细胞,其本身也为DNA分子。

合适的载体有如下要求：必须能 自我复制。有可克隆位点 ,供外源DNA插人。有可供选择的遗传标记 ,如抗药性基因、酶基因、营养缺陷型等。载体应尽量小 ,抗剪切力。表达型载体应具备与宿住基因相应的启动子、增强子、前导序列。常用的载体有：质粒载体、入噬菌体、粘粒、丝状噬菌体、病毒载体、酵母人工染色体卡粒载体。

3.3目的基因的体外重组

目的基因的体外重组即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。重组有如下方法：:粘粒末端法 ,且常用双标记法。平头末端连接法 ,用T4DNA连接法。人工接头法,其大小应为8─12bp。用同聚物接尾法 ,常用cDNA法。

3.3.1粘性末端连接法：当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。

3.3.2人工接尾法：即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，采用此方法。首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。

3.3.3人工接头连接法：将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的DNA片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。3.4重组DNA导入宿主细胞

重组子构建后 ,必须送人宿主细胞使之发挥作用 ,常用物理方法、化学方法和生物方法。其一般过程为：

（1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。（2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。

（3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。3.4.1物理方法

3.4.1.1基因枪法 该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。

3.4.1.2电激法 是利用高压电脉冲的作用对原生质体或细胞击出微孔而使基因转移的一种新方法。

3.4.1.3激光微束法，此方法是利用直径很小、能量很高的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔的原理，在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源代替荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔，处于细胞周围的外源DNA分子随之进入细胞。

3.1.4.4超声波法基本原理：是利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使外源DNA进入细胞。3.4.2化学方法

3.4.2.1PEG法(聚乙二醇)PEG是细胞融合剂，它可以使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，促使相互之间的接触和粘连；还可以引起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，从而有利于细胞膜之间的融合和外源DNA进入原生质体。

3.4.2.2脂质体法

脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜结构，可将DNA包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内。3.4.3生物方法

3.4.3.1转化 以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程 3.4.3.2转染 以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程 3.4.3.3转导 以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程 3.5重组DNA的筛选与鉴定

基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。

3.5.1克隆基因表达有三个条件： ⑴ 基因的编码区不能被插入序列中断

⑵ 基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主细胞的RNA聚合酶有效地识别 ⑶ mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。

3.5.2筛选含重组体的阳性菌落的方法：平板筛选、限制酶切图谱筛选、PCR筛选重组体、原位杂交技术。

3.5.2.1平板筛选

平板筛选是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法。具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素的培养平板上生长；未转化的则不能生长。

(1)插入失活 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。

(2)蓝-白筛选 利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去α-互补能力,含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。而没有重组质粒的转化子产生α-互补，在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。

3.5.2.2原位杂交技术

原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。

3.5.2.3限制酶切图谱筛选

所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。

4用基因工程获得抗生素高产菌株的实例

青霉素G酞化酶活力的提高[5] 青霉素G酞化酶可把青霉素G转化为 6一APA,它是新合成或半合成青霉素的有用原料 ,在抗生素工业中有着重要作用 ,因大肠杆 菌ATC-CL105菌株可产生青霉素G酞化酶,可将这种酶基因连接于一个多拷贝质粒载体上 ,通过基因测量应提高青霉素G酞化酶活力水平 ,用装配型质粒克隆系统进行青霉素G酞化酶基因的克隆,ATC-CL105菌株DNA用 ΗindⅢ切开并插人装配型质粒上 ,得到由3000个克隆组成的ATC-CL105的基因文库,克隆带有青霉素G酞化酶基因被生物测试系统选得 ,文库的单菌落涂布于含有青霉素G和一株对6一APA敏感的粘质少母氏菌菌株的软琼脂上,产生青霉G酞化酶的克隆通过对敏感性测试菌抑制 圈来识别 ,筛选文库中的 10000个菌落,获得一个阳性克隆,把亚克隆青霉素G酞化酶基因转移于PBR322质粒上,该质粒在每个细胞中扩增约50个拷贝,但酞化酶只增产6倍,大肠杆菌中PBR322质粒上的克隆青霉素G酞化酶基因在发酵条件下使用相当稳定。

参考文献：

[1]吴裕本,林潘平.某些木霉菌株的产酶高峰及其纤维素酶制剂饲喂兔的试验〔J〕.福建农业大学学报 1994, 23(3)[2]邓芳席,刘素纯.腐乳毛霉菌种选育及产酶条件研究〔J.湖南农学院学报 1995,21(1)[3] 潭周进,喻科,李仲强,等.霉菌腐乳品质的影响因素研究〔J.食品与机械 2002，(2)[4]彭志英主编.食品生物技术导论.北京:中国轻工业出版社，2010，（9）[5]王狱 ,方金瑞 ·抗生素 科学 出版社1988,220-111,