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酵母基因工程菌的构建过程及其在食品领域中的应用
随着科技的发展，食品生物技术在食品工业发展中的地位和作用越来越大，已经渗透到食品工业的方方面面，特别是基因工程技术等技术在21世纪的食品工业中充当重要的角色。而工程菌就是用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系，是采用现代生物工程技术加工出来的新型微生物，具有多功能、高效和适应性强等特点。主要应用于治理海洋石油泄漏，生产基因工程药物，酵母基因工程中等方面。而酵母基因工程中，酵母基因工程菌就是菌类细胞株系用的是酵母菌，能够发挥着一定的功能，可以提高发酵的效率。酵母基因工程的优点：1.是真核生物，大多具有价高的安全性。2.繁殖速度快，能大规模生产，具有降低基因工程产品成本的潜力。3.将原核生物中已知的分子和基因操作技术与真核生物中复杂的转运后修饰能力相结合，能方便外缘基因的操作。4.采用高表达启动子，可高效表达目的基因，而且可诱导调控。5.提供了翻译后加工和分泌的环境，使得产物和天然蛋白质一样或类似。6.酵母菌可表达外源蛋白与末端前导肽融合，指导新生肽分泌，同时在分泌过程中可对表达的蛋白进行糖基化修饰。7.不会形成不溶性的包涵体，易于分离提纯8.移去起始甲硫氨酸，避免了在作为药物中使用中引起免疫反应的问题。9.酵母菌（主要是酿酒酵母）已完成全基因组测序，他具有比大肠杆菌更完备的基因表达控制机制和对表达产物的加工修饰和分泌能力。10.酵母可进行蛋白的N-乙酰化，C-甲基化，对定向到膜的胞内表达蛋白具有重要意义。构建基因工程菌是一个复杂、繁琐的过程，因此构建酵母基因要注意：
1、结构简单，易于研究
2、繁殖能力强，数目多
3、成本低，易于培养、4易于观察。
一． 酵母基因工程菌的构建过程： 1.目的基因的获取：
获取目的基因是实施基因工程的第一步，有三种方法提取目的基因。（1）从自然界中已有的物种中分离出来：.从基因文库中获取目的基因（俗称：鸟枪法）：将含有某种生物的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物不同的基因，称为基因文库。当需要某一片段时，根据目的基因的有关信息，如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。（2）.化学合成法。已知目的基因的核苷酸序列，可用DNA合成仪直接合成。（3）用PCR技术扩增技术提取。已知目的基因引物的序列，将整个DNA放入合成仪，因为只有当引物与模板结合后DNA热聚合酶才能行使聚合功能，所以只有引物中间的目的基因被大量扩增，即被提取出来。2.选择合适的载体并插入目的基因：
基因表达载体的构建，即目的基因与运载体结合。是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同
一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。基因表达载体由目的基因、启动子、终止子、标记基因四部分组成。基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒，即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。作为基因工程使用的载体都要进行人工改造后满足以下条件才能用于基因工程操作：（1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。（2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。（3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。（4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。（5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。
3.将目的基因导入酵母菌即受体细胞内：目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后。用人工方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。例如，如果运载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，以增大细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌的繁殖速度非常快，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。
4.将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增：重组的DNA分子进入细胞内就会 大量扩增。
5.目的基因的监测与鉴定：运用DNA分子杂交技术来检测目的基因，分子杂交技术检测mRNA，抗原抗体杂交技术检测蛋白质
二．酵母基因工程菌在食品领域中的应用
1.面包酵母的应用：
随着重组DNA技术的发展，酵母在其发酵的形式、原料成份及工艺流程等方面都发生了极大的变化。新的基因工程酵母茵具有提高CO 的产速率，增强对外界环境压力的抵抗力，并且还能够产生新的蛋白和其它代谢物来改进面包等的风味．延长酵母的保存期限。
酵母具有发酵面团的特性，它能产生CO 使面包保持蜂窝结构，同时还赋予面包特殊的风味，因此很早就为人们所利用。产气速率在酵母的发酵过程中是极为重要的，它不仅与面团的成份有关，还与面包酵母的内在性质密切相关。为了适应冷冻技术在面包发酵方面的应用，须使酵母在冷冻后仍保持较快的生长速率和较强的发酵能力。而大量资料表明，通过基因工程技术构建酵母基因工程菌，不仅可以改善面包酵母内在的发酵特性，如产气速率、发酵速度、发酵能力等，还可以提高发酵产品质量，扩大原料利用范围等。
酵母生产，一般采用糖蜜或其它碳源培养基培养细胞并能获得较高的菌体浓度，但如果利用基因技术，则会给酵母的工程生产带来新的突破。例如乳清是奶酪业的一种无用副产品，主要成份是乳糖，其降解过程需要消耗大量的氧，因此对环境存在潜在污染。面包酵母由于缺乏B一半乳糖苷酶和乳糖透性酶，不能利用乳清。但乳清可以被K．1aetis和K．fragilis所利用，将K．1aetis中分别表达B一半乳糖苷酶和乳糖透性酶的LAC4和LAC12基因或E．eoli(或A．niger)的B一半乳糖苷酶基因构建至酿酒酵母，就可使酿酒酵母利用乳清发酵，其生产效果可与酵母在糖蜜中发酵相媲美。此外，构建可降解淀粉和木质纤维素的基因工程酵母，不仅可简化上述两种原料的预处理过程，降低成本，还避免了在预处理过程中可能混入的一些不利于酵母生长的物质，从而提高酵母产品质量。但由于降解淀粉或木质纤维素往往需要多种酶共同作用，因此需要在酵母中转人多种基因方可发挥作用。
重组DNA技术的广泛应用，使构建具有新性质的面包酵母成为可能，这将给面包生产市场带来巨大的经济效益。在不久的将来，面包酵母将会在新的原料如淀粉、纤维素废物或乳清中生长。更经济、更环保和更可行的工艺也将应运而生。同时，随着酵母生物技术的发展，那些存在潜在污染的资源也将变成宝藏。利用基因克隆技术使外源酶在酵母中表达，则可避免使用添加剂，节约成本，改进终产品的质量，减少或消除工作人员对添加酶的过敏反应。重组菌株的商业应用也会遇到诸多问题，如技术缺陷以及公众接受方面。再比如，改进菌株的CO2产气速率,在有效的缩短酵母发酵时间的同时，也大大减少了面包中的香味成分。但无论如何，目前的面包生产的确需要这类面包酵母基因工程菌，通过对酵母特性的控制，可直接影响面包生产的技术工艺和最终产品质量。
2.葡萄酒酵母的应用：
葡萄酒酿酒酵母是葡萄酒发酵当中最主要的微生物，它的性能不仅直接影响葡萄酒的产量、质量和经济性。还对葡萄酒特色的形成有很大影响。为了提高葡萄酒的市场竞争力和商业价值．缩短发酵周期和降低生产成本，进而提高企业的竞争优势和获利能力，我们有必要对酿酒酵母进行选育、基因改良和构建工作。随着1996年酿酒酵母全基因组测序工作的完成．利用基因工程技术构建酿酒酵母基因工程菌已经成为当前的主流。并且，科学家们也为酿酒酵母相应地构建了多种有救的质粒载体及探索出相应的基因转化方法。
葡萄酒中苹果酸含量较高时，会影响酒的品质，需要对其进行降酸处理。由于酿酒酵母分解苹果酸的能力比较低，因此通常在葡萄酒酒精发酵后接种乳酸前进行苹果酸一乳酸酵．从而使葡萄酒的酸度降低网。此外。粟酒裂殖酵母通过苹果酸一酒精发酵，也能将苹果酸分解为酒精和CO2。但由于苹果酸一酒精发酵会产生异味物质．因此不能直接用于葡萄汁(酒)的生物降酸。随着对乳酸菌和酵母苹果酸代谢相关酶系研究的深入及分子遗传转化技术和基因工程技术的发展，将乳酸菌和粟酒殖酵母中苹果酸降解相关基因导入酿酒酵母细胞中。可以构建苹果酸-乳酸酵母和苹果酸一酒精酵母，使之既能进行酒精发酵，又能降解苹果酸。从而简化葡萄酒的发酵工艺。
3.酿酒酵母的应用： 几个世纪以来，酿酒酵母一直被用于食品发酵生产，但其不能发酵利用淀粉。但淀粉价格低廉，是一种很有潜力的生物资源．发酵行业一直借助淀粉酶来应用淀粉。不过外加酶可能对啤酒风味等产生不利影响，既浪费原材料又提高生产成本。与酿酒酵母有很近亲缘关系的糖化酵母可分泌糖化酶利用淀粉和糊精，但同时也赋予啤酒浓重的酚醛味，不适于啤酒生产。结林卡油脂酵母可以分泌q一淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶等淀粉水解酶，是有效的水解淀粉的酵母。但其生长缓慢，乙醇耐受力低，同样不适于啤酒生产。所以对酿酒酵母进行遗传改造使其直接利用淀粉是解决这些问题的最佳方案。近几年用不同来源的d一淀粉酶基因构建酿酒酵母工程菌的研究不少。其中包括来自动植物组织的Ⅱ淀粉酶基因；来自原核生物解淀粉芽孢杆菌，U淀粉脱枝假单孢菌的d一淀粉酶基因；来自低等真核生物西方许旺酵母的口一淀粉酶基因及不同曲霉的淀粉酶基因。各种来源的淀粉酶基因在酿酒酵母工程菌中表达效率不尽相同。通过基因转化可以向工业菌株引进新基因，使其具有新性状，利于发酵生产。
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