酵母菌分类学的研究进展王志伟_酵母菌研究进展

酵母菌分类学的研究进展王志伟由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“酵母菌研究进展”。

酵母菌分类学的研究进展

07级农学系生物技术2班王志伟0701024208

一、摘要随着生物技术的发展,一些新方法应用于酵母菌分类中,使酵母菌分类学研究从过去的传统分类系统过渡到以遗传特征（DNA序列）为主要依据的现代分类系统。本文将介绍脉冲电泳核型分析(PFGE)、PCR-LFP和RAPD 3种分子生物技术的方法、原理,以及在酵母菌分类鉴定方面的应用现状,并指出了各种技术的局限性和应用前景。

关键词：脉冲电泳核型分析(PFGE)PCR-LFPRAPD应用进展

二、简介经典分类学方法在酵母菌分类中的应用

经典分类学方法是酵母菌分类学方法的基础,包括形态学特征和生理生化特征。形态学特征包括宏观特征(菌落特征)、微观特征(细胞形态、无性繁殖方式、有性生殖方式、孢子类型、假菌丝的形成)等;生理生化特征包括对糖发酵和碳、氮源化合物同化的能力,对外源维生素的依赖性和不同温度下的生长能力等生理学特性。但是，随着酵母菌资源库不断丰富和新种不断被发现，单靠经典的形态学和生理生化差异作为酵母菌种间鉴别依据有时是不够的。所以现在该法只能作为酵母鉴定系统的基础辅助其他分类方法使用。

三、分子分类学方法在酵母分类中的应用

rDNA序列分析是近年来广泛应用的用于判断不同分类群亲缘关系远近的指标, 在rDNA中, 26SrDNA(LSU)和18SrDNA(SSU)以串联重复的方式排列,在细胞内有数以百计的拷贝,增加了扩增成功的可能性。rDNA内某些片段具有高度的保守性,同一细胞内不同拷贝的rRNA基因序列,因协同进化作用而被均一化,因此每一拷贝的序列是相同的。当前酵母分类中最为常用的包括18SrDNA、26SrDNA D1/D2区、ITS区等[1]。序列分析的大致流程是:活化菌株,提取目的菌株的基因组DNA,并以此为模板使用酵母菌通用引物扩增相应的区域,扩增产物经电泳检测,纯化后进行测序;将测序得到的序列提交到Genbank等核苷酸数据库,与库中所有酵母菌的同源序列进行相似性比较,与相似度最高的序列的碱基差异越小, 成为该序列所对应菌种的可能性就越大。也可以从核苷酸数据库中下载同源序列,构建系统发育树,研究菌株的系统发育地位。

3.1脉冲电泳核型分析(PFGE)：

脉冲电泳是一种可在琼脂糖凝胶中将不同大小的完整染色体DNA分子分开的技术；核型分析就是应用脉冲电泳方法发展起来的一种新的实验技术,把整个染色体包埋在琼脂糖凝胶中,依赖染色体的大小和立体结构（代表了一个生物所含有遗传物质的多少及其组成形态,该特征随物种变化而变化,因而具有特定的系统分类学意义）及在凝胶中的不同迁移速度把基因组分离成染色体带[2 ]。简要的实验步骤包括原生质体制备、制胶、电泳、凝胶的溴化乙锭染色观察4个过程。而影响PFGE 成败的因素主要有两种:一是完整染色体DNA 的制备,二是合适的脉冲电泳条件。脉冲电泳的原理是通过电场不断改变, 迫使DNA分子的泳动方向做相应的改变,小的DNA分子比大的变形快,故前者比后者泳动速度快,从而将不同大小的DNA分子分开[3]。随着脉冲电泳仪的改进以及完整染色体DNA提取方法的发展,脉冲电泳技术越来越多的被应用于酵母菌的分类学研究中，又因为PFGE分析带型清晰易辨、分辨力较强,可达10000 kb 以上,适用于近缘关系菌株的分类研究，可作为变种鉴别和种内分型的新基因型方法，故而它对于酿酒酵母菌在传统方法分属后的进一步分类有重要作用。

3.2限制性片段长度多态性DNA(PCR-LFP)

RFLP即限制性片段长度多态性(restriction ragment length polymorphism)是REFP 的改进形式,它采用DNA 探针和分子杂交技术,特异性更强。PCR-LFP 是将PCR扩增的基因组DNA用限制性内切酶酶解,经电泳分离后表现的限制性片段长度差异，酵母基因组含有丰富的遗传信息,且有较大差异,不同菌株的同源序列（5.8S-ITS区域的PCR-RFLP使用得最为广泛[4]）肯定具有不完全一致的酶切位点，,这为该方法在酵母菌分类上的应用提供了可能。，核糖体存在于所有生物细胞中,几乎有一个共同的起源,而且某些rRNA 序列对所有的同源生物是相当保守的,从而可以确定所有生物的分类地位。核基因组rDNA 的内转录区间ITS(Internal Transcribed Spacer)适用于种以下的分类和鉴定。利用引物扩增rDNA 的ITS 区域,用限制性内切酶消化,不用杂交,也可获得RFLP图谱。FERNANDEIESPLNAR 等扩增5.8SrRNA ,包括了内转录区间ITS1和ITS2 ,扩增后的基因数目从700～870 bp不等,以此对酵母菌进行RFLP鉴定分析[3 ]。

Kuhlea 等(2001)用PCR-FLP分析法分析了啤酒中的酵母类群CECT-ATA联盟建立了一个网上酵母菌鉴定数据库(http: / /www.daodoc.com /)里面存储了酵母菌5.8S-ITS 片段及经Cfo I、Dde I、Hae III, HinfI限制酶酶切后的信息,只需将菌株扩增的5.8 S-ITS片段大小和经酶酶切后的片断数量及大小

[5]输入数据库,就可快速简单地鉴定一个菌株到种。

3.3 随机扩增多态DNA(RAPD)

RAPD(随机扩增多态DNA)是在PCR 技术的基础上发展起来的一项多态分析新技术。其原理是利用大约10 个碱基的随机引物以PCR 技术为基础，对整个基因组DNA 进行扩增，得到多个片断，再利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测个体间扩增出的片断的多态性，可以辨别出菌株间基因组DNA 内核苷酸序列存在的微小变异[6]。由于该方法中选用引物的碱基是随机的,所用引物可达成百上千,可检测到生物体的整个基因组,既能检测有功能的基因编码区,又能检测到重复序列区。与RFLP相比RAPD 大大减少了如制备克隆、Southern印记、分子杂交

[7]等准备工作,简化了技术过程所需的条件 ,它以随机寡核苷酸为引物,比RFLP

多态片段短许多,更方便种与亚种的鉴别。

RAPD 的主要缺点有: ①RAPD 标记中的EB 染色带往往是一种混合标记,是在基因组DNA 中扩增位点不一,长度可能相同或不同的一组片段的混合片段标记;②RAPD 的扩增带多为显性标记,不能区分个体基因型是纯合型还是杂合型;③稳定性和重复性较差。

四、展望

酵母菌分类学方法的发展趋势应该是向着简便、快捷、准确、合理的方向发展。就当前情况来看,任何一种方法都不完美,只有将各种方法结合起来使用,才能达到令人满意的鉴定效果。随着生物技术正越来越多地应用于酵母菌的鉴定，目前流行的鉴定程序是,首先对酵母菌进行形态特征, 在此基础上对DNA测序分析,多种方法综合运用就会得到较为满意的结果。分子分类学方法的研究为酵母菌的分类展示了广阔的前景和越来越重要的作用。

五、参考文献：

[1] 王庆国.刘天明.酵母菌分类学方法研究进展微生物学杂志 2007年5月第27卷第3期

[2] 刘永翔.刘作易脉冲电泳技术在真菌研究中的应用贵州农业科学 2004 ,32(5):82～83

[3] 毛志群.张伟.马雯.分子生物技术在酵母菌分类中的应用进展河北农业大学学报2002年5月第25 卷增刊

[4] 卢君.李艳酿 分子生物学技术在葡萄酒相关酵母菌分类鉴定中的应用及研究进展酒科技2009 年第6 期（总第180 期）

[5] KUHL E A , J ESPEREN L , GLOVER R L K.Identification and characterization of S accaromyces cerevisiae strains isolated from West African sorghum beer[J ].Yeast ,2001 ,18(1):106938