酵母菌分类方法研究张金龙_酵母菌的5种鉴定方法
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酵母菌分类方法研究
学生姓名：张金龙系别：农学系专业班级：生物技术2班学号：0701024228指导老师：卢显芝
2010年6月
摘要：酵母菌是一个复杂的类群,其分类系统经数代酵母菌分类学家的努力正日趋完善,分类学方法也随着科学技术的进步而不断深化, 尤其是近年来发展起来的分子分类学方法给整个生物系统学和进化研究方法注入了活力,也使酵母菌的系统发育研究更接近于生物起源的本质。
关键词：酵母菌分类方法化学分子生物学技术
酵母菌是一类单细胞的真核微生物的通俗名称，并非是系统分类单元。酵母菌属 于真菌，是具有核膜与核仁分化的较高等的微生物，细胞内有线粒体等较复已杂 的细胞结构。目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子（子囊孢子和担孢子）的能力，可将酵母菌分成3类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌。在真菌分类系统中分别属 于子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类。[1]与其他微生物相比，尤其是细菌和丝状真菌，酵母菌的种数很少，但是其分布范围却很广泛。酵母菌大多数为腐生，生活在含糖量较高和偏酸性的环境中，如水果、蔬菜、花蜜及植物叶子上，尤其是果园、葡萄园和菜园的土壤中较多。
由于酵母菌拥有丰富的酶系统和蛋白质，对高糖环境、高碳环境、高渗透压环境等具有较强适应性，可以为其他生物体提供营养物质，可以代谢重金属或者降解某些难降解的物质，维持生态环境的稳定。[2]因此分类研究作为其他各方面研究的基础，研究手段不断改进，分类系统不断更新。
其中大致有三种分类方法：传统分类方法、化学分类方法、分子生物学分类方法。1 传统分类方法
传统分类学方法是酵母菌分类学方法的基础 ,包括形态学特征和生理生化特征。形态学特征包括宏观特征(菌落特征)、微观特征(细胞形态、无性繁殖方式、有性生殖方式、孢子类型、假菌丝的形成)等；生理生化特征包括对糖发酵和碳、氮源化合物同化的能力 ,对外源维生素的依赖性和不同温度下的生长能力等生理学特性。经典分类学方法在酵母菌分类学中占有重要地位 ,当前权威的酵母鉴定系统就是在此基础上建立并发展起来的。
然而,它存在的局限性也是不容忽视的。酵母菌形态学特征可能随着培养基的改变而发生变化,因此必须采用标准化方法;有些种类或结构不同的碳水化合物具有相同的代谢途径 ,它们所反映的遗传基础是有限的;有些双糖、寡糖和多糖代
谢的初始阶段往往是由单个可变基因控制,造成鉴定结果的不稳定;形态学特征观察费时耗力,操作周期长达数周。[3]化学分类方法
2.1 同工酶电泳
同工酶电泳在微生物分类中广泛应用,而且有不少成功的实例,以蛋白质的分子性状和电泳技术为基础的同工酶的电泳分析就是其中之一。同功酶分子结构和大小的不同反映了基因结构的不同,即从侧面反映菌株间的遗传信息和系统演化关系。曾用于酵母分类研究的同工酶有酯酶、过氧化氢酶、超氧化歧化酶、苹果酸脱氢酶等。[4]
同工酶电泳方法简单易行,能精确地反映菌株之间的微小差异,适用于红酵母属的种级分类,也适用于种下分群,可以作为传统酵母菌分类的一个重要辅助手段。
2.2 辅酶Q的类型分析
辅酶Q的类型分析常用于酵母菌的分类。辅酶Q是一种类维生素物质,是呼吸链中一些重要的辅酶,在电子传递系统中作为电子载体,普遍存在于原核和真核生物中。其作为分类的基础在于其异戊烯基侧链单元的长度,根据苯环一侧异戊二烯单元构成的侧链数(n)可将酵母菌的辅酶Q类型分为Q-6至Q-10,且具有属内专一性。子囊菌酵母的辅酶Q类型为Q-6至Q-9,担子菌酵母为Q-9至Q-10。目前,对酵母菌泛醌类型的确定一般采用高效液相色谱法(HPLC)、质子核磁共振谱法(NMR)或反相薄板层析法。[5]
在酵母菌分类中,辅酶Q可作为区分子囊菌和担子菌及判断属内异源性的参考指标,也可作为酵母菌分类的重要辅助手段。
2.3 脂肪酸和多糖分类法
20世纪70年代,脂肪酸在微生物分类中的作用引起微生物分类学者的注意,但到80年代初才真正把全细胞脂肪酸用于酵母菌分类,先后有人对假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属和酿酒工业用酵母菌等类属酵母菌的脂肪酸作了测定,并根据脂肪酸数据对这些酵母菌分群,提出一些用脂肪酸进行快速鉴定的方法。还有人根据全细胞脂肪酸对某些属种的亲缘关系作了探索,对脂肪酸数据进行处理和分析,也有应用聚类分析或求相关系数的方法,多数作者只直接根据脂肪酸含量的差异对菌株进行分类,因为脂肪酸含量为数量性状,在菌株较多时只有用多元统计分析的方法才能对结果做出较科学的解释。此外,酵母胞壁甘露聚糖的糖分分析法和核磁共振氢谱(PRA)测试法也曾用于酵母的分类和鉴定。[6]
由于脂肪酸分类法和多糖分类法能反映的信息有一定局限性,操作繁琐,可靠性差,近几年来,这方面的报道甚少,已基本退出酵母菌分类鉴定,仅有少部分指标仍作为酵母分类的辅助手段。分子生物学分类方法
3.1 DNA序列分析
随着DNA序列分析技术的日趋成熟和简易化，序列分析方法已经被广泛应用于酵母菌的分类鉴定以及系统学研究。其中，rRNA基因（rDNA）及其转录间区（ITS）的序列是最为常用的，包括18S rDNA、26S rDNA的D1/D2、ITS、5.8S rDNA。这些序列均己经公布于GenBank/EMBL/DDBJ等国际核酸序列数据库，为酵母菌的分类鉴定带来极大的便利。序列分析的大致流程是：活化菌株，提取目的菌株的基因组，并以此为模板使用DNA酵母菌通用引物扩增相应的区域，扩增产物经电泳检测，纯化后进行测序；将测序得到的序列提交到GenBank等核苷酸数据库，与库中所有酵母菌的同源序列进行相似性比较，与相似度最高的序列的碱基差异越小，成为该序列所对应菌种的可能性就越大。也可以从核苷酸数据库中下载同源序列，构建系统发育树，研究菌株的系统发育地位。[7]
3.2 DNA限制性酶切片段多态性(RFLP)
RFLP是 REFP的改进形式,采用 DNA探针和分子杂交技术,特异性更强。RFLP是将不同菌株PCR扩增的产物用限制性内切酶进行酶切,由于不同菌株的同源序列往往具有不完全一致的酶切位点,因此酶切产物经电泳分离后会表现出片段长度差异。[8]酵母基因组含有丰富的遗传信息,不同菌株的DNA序列具有不完全一致的酶切位点,这就为酵母菌分类上的应用提供了可能。
3.3 随机扩增多态DNA（RAPD）
RAPD(随机扩增多态DNA)是 WIUIAMSJ 和 WELSHJ 两个研究小组于1990 年同时提出的一项多态分析新技术,是在PCR技术的基础上发展起来的。由于该方法中选用引物的碱基是随机的,所用引物可达成百上千,可检测到生物体的整个基因组,既能检测有功能的基因编码区,又能检测到重复序列区。与 RFLP相比,RAPD
大大减少了如制备克隆、Southern 印记、分子杂交等准备工作 ,简化了技术过程所需的条件 ,它以随机寡核苷酸为引物,比 RFLP多态片段短许多,更方便种与亚种的鉴别。[9]
RAPD的主要缺点有:
(1)RAPD标记中的EB染色带往往是一种混合标记,是在基因组DNA中扩增位点不一,长度可能相同或不同的一组片段的混合片段标记。
(2)RAPD的扩增带多为显性标记,不能区分个体基因型是纯合型还是杂合。
(3)稳定性和重复性较差。
3.4 DNA-DNA杂交
虽然目前已能够对长达几千个碱基的DNA片段进行序列分析,但进行全序列分析实际操作中仍有难度。然而,DNA杂交可以找出 DNA之间的核苷酸序列互补程度,从而推断不同酵母菌基因之间的同源性。[9]将2个菌株的变性DNA混合在一起,在一定条件下单链 DNA分子复性形成杂合分子,亲缘关系愈近的菌株, DNA序列就愈相似,从而复性就完全,即同源百分率越高。DNA同源性分析一般用于区分形态学方法不易鉴定的酵母种类,最适于亲缘关系较近的菌株。现在普遍认为同源率在70%以上代表同一种,同源率40%-70%之间的代表同一种内亲缘关系比较远的菌株 ,40%以下则被认为代表不同的种。测定方法主要有固相法和液相法。固相法是将DNA固定于支持物滤膜上,通过DNA间的相对结合率来计算同源率的一种方法;而液相法的DNA-DNA杂交在溶液中进行,通过测定其熔点温度差异来计算同源率。
3.5 GC含量分析法
GC含量是指 DNA碱基中G+C碱基对的摩尔百分比,是最早用于酵母菌分类学研究的分子生物学技术,也是DNA特征值中最简单的一项。[10]它反映了DNA在碱基组成上的差异,可作为酵母菌种级水平的分类参数。通常酵母菌的GC含量在27%～70%,担子菌酵母为50%～70%,子囊菌酵母为27%～50%。GC含量的测定方法主要有 3种,即热变性法、浮力密度法和高效液相色谱法。其中,热变性法因操作简便、重现性好应用较为广泛。不同种属酵母 DNA的GC含量一定不同,但相同的GC含量的菌株未必是相同或相似种。因此,GC含量仅适用于亲缘关系较近的菌株,对于亲缘关系很远的菌株可能具有相同的GC含量。
3.6 脉冲电泳核型分析（PFGE）
脉冲电场凝胶电泳可以在琼脂糖凝胶中用电泳分离。完整的酵母染色体DNA 分子从而测定酵母细胞染色体条数及其大小。染色体条数、大小和形态结构,代表了一个生物所含有遗传物质的多少及其组成形态该特征随物种变化而变化,因而具有特定的系统分类学意义。脉冲电泳的原理是通过不断改变电场,迫使 DNA分子的泳动方向作相应的改变,小的 DNA分子比大的变形快,泳动速度快,从而将不同大小的 DNA分子分开。随着脉冲电泳仪的改进以及完整染色体DNA提取方法的发展,脉冲电泳技术越来越多地被应用于酵母菌的分类学研究中。[11]
3.7 其他核酸分析法
3.7.1 实时 PCR法
这种方法是通过在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程的定量分析方法。如有人用实时PCR对 Candida sp.和果汁腐坏酵母进行了检测和鉴定。
3.7.2 基因芯片法
随着人们对酵母基因组序列的了解和掌握,可以设计出大量的核酸探针并将其固定在一定的介质上,通过DNA-DNA杂交方法,这些探针能够扩增出基因组上的 ORF或者原位表达一些序列以达到检测和鉴定的目的。近年来,出现一种新的DNA-DNA杂交方法,即基因芯片法,它们拥有约6000个酵母基因的DNA微阵列一比较基因组杂交法。目前,Candida albicans的基因芯片的研究已经初见成效。
3.7.3 RNA二级结构
RNA二级结构用于微生物分类正逐渐进入人们的视野。研究表明,RNA二级结构比其一级结构在进化上具有更高的保守性,基于一级结构的RNA二级结构预测使得大量RNA二级结构易于获得。RNA二级结构能够将比较重要的某一个或几个碱基突变进行放大化,而在序列比对中却只能将其作为一般的碱基差异进行分析。[12]综合以上方法，各种分类鉴定酵母菌的方法都有各自的优势与劣势，并非任何一种方法都适用于所有的酵母菌鉴定,甚至使用不同的方法会产生不同的结果。要想达到满意的分类结果一般都需要结合多种的分类手段，或根据不同的菌种采用特定的鉴定方法，随着技术的不断更新进步，新的更加准确、高效、快捷和廉价的酵母分类鉴定手段将会发展起来，酵母菌的分类系统也将会不断地发展完善。
参考文献：
[1]孙万儒.酵母菌[J].生物技术通报,2007,42(11).[2]杨清香,王哲.酵母菌在自然界中的生态分布及功能[J].环境科学与技术,20009,32(4).[3]王庆国,刘天明.酵母菌分类学方法研究进展[J].微生物学杂志.2007,27(3).[4]魏艳敏,周与良.红酵母属同工酶谱分析及其分类研究[J].菌物系统,1998,17(1).[5]王登全,江东福,马萍.酵母菌分类中泛醌类型的一种快速简便的鉴定方法[J].生物学杂志,1994,58(2).[6]李明霞,付秀辉,卢乡怀.现代酵母菌分类鉴定方法与新持术(续)[J].微生物学通报,1992,19(2).[7]白逢彦.假丝酵母属的分类学研究进展[J].生物技术通报.1997,24(6).[8]唐玲,刘平,黄瑛.酵母的分子生物学鉴定[J].生物技术通报,2008,(5).[9]杨智,杨振泉,汪志君.RAPD技术在酿酒酵母分类鉴定与遗传育种中的应用[J] 现代食品科技.2007,(2)．
[10]毛志群，张伟,马雯.分子生物技术在酵母菌分类中的应用进展[J].河北农业大学学报.2002,(25).[11]白逢彦，贾建华.脉冲电泳核型分析在酿酒酵母菌分类学研究中的应用[J].微生物学报.2000,19(2).[12]刘杨,崔晓龙,李文均.RNA二级结构在微生物系统发育分析上的应用[J].微生物学通报,2006,33(2).
