生物类(生物科学等)专业毕业论文_生物科学专业毕业论文

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RLK基因遗传转化植株的筛选与鉴定

生物技术专业

指导教师

摘要：番茄青枯病是严重影响番茄生产的病害之一，有“植物中的癌症”之称。植物体中类受体蛋白激酶(Receptor Likekinase RLK)有提高抗逆性的功能，本研究利用分子克隆技术将辣椒中的。基因转入番茄中，以期获得对青枯病具有抗性的番茄植株。除了利用传统的形态学比较的方法外，本文主要利用PCR和RT-PCR技术对三个番茄品种的转基因植株的T1代进行转基因后的分子鉴定。结果显示，三种转基因番茄经特异引物PCR后均能产生特异性条带，而且D-RLK-6号经RT-PCR后能够产生特异的条带，这表明目的基因都已经成功转入三种转基因番茄基因组内，并且能够顺利遗传给后代，另外D-RLK-6号的CaRLK基因能够顺利表达。此研究将为番茄青枯病的防治提供重要的理论支撑。

关键词：番茄；CaRLK；分子鉴定；PCR ；RT-PCR

The Selection and Identification of CaRLK Transgenic Tomatoes Plants

Tomato bacterial wilt is a serious disease affecting tomato production and it is called “the Cancer Abstract：of Plant”.The Receptor Likekinase(RLK)in plants can increase their resistance function.In this study, we used molecular cloning technology to transfer the CaRLK from pepper to tomato, hoping to obtain bacterial wilt-resistant tomato plants.In addition to using traditional methods, such as morphological comparison, we mainly used PCR and RT-PCR to identify the three varieties of transgenic tomato plants of T1 generation of D-RLK-2, D-RLK-6 and D-RLK-10.ResuLts showed that three transgenic plants after the proce of PCR by specific primers were able to produce specific bands, and that the D-RLK-6 produced specific band after the proce of RT-PCR by specific primers, suggesting that the CaRLK gene had been succefully transferred into transgenic tomato genome.This study will provide important theoretical support for the prevention and control of tomato bacterial wilt.Key words ： Lycopersicon escuLentumMill；CaRLK；Molecular identification；PCR；RT-PCR

引言

番茄(Lycopersicon escuLentumMill)别名西红柿，古名六月柿、喜报三元。其果实营养丰富，具特殊风味，既可以作为水果又能作为蔬菜食用，可以生食、熟食、加工制成番茄酱、汁等。番茄因其产量高、营养丰富，深受人们的喜爱，是全世界栽培最为普遍的果菜之一，美国、苏联、意大利和中国为主要生产国。在欧洲、美洲的国家以及中国和日本有大面积温室、塑料大棚或者其他保护地设施栽培。中国各地普遍种植，栽培面积仍在继续扩大，但是由于连年种植造成的连作障碍严重，病害达40多种[1]，其中青枯病是严重影响番茄产量和质量的病害之一。

植物青枯病菌具有广泛的寄主能够侵染54个科的450多种植物[2]，仅次于农杆菌的侵染性，是许多植物生产的重要限制因素[3]，其中番茄、烟草和马铃薯等茄科作物受害最为严重。由于植物叶片被青枯病菌侵染发病枯死以后仍保持绿色或者浅绿色，故称青枯病。番茄青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearun)引起的，在热带、亚热带、温带地区广泛发生的一种细菌性土传病害[4]，番茄在发病时，尚无特别有效的药物或者方法进行防治，因而被称为植物的“癌症”，是世界上分布最广、危害最为严重且最难防治的重大细菌性病害。番茄青枯病在我国台湾及长江流域的各省均有发生，尤其以四川、湖南、江西、浙江、福建、广东、广西等地发病最为严重。番茄青枯病一般年份病死株率为20%-30%，发病严重时，田块病死株率可达80%以上，甚至造成绝收[5]。更糟糕的是，近年来由于“温室效应”所导致的全球气候变暖，该病菌还表现出向高纬度地区蔓延的趋势，给作物生产带来极大的威胁，在我国该病已经蔓延到了内蒙古和宁夏地区。

由于番茄对青枯病的抗性的遗传机制比较复杂，到目前为止人们对青枯病的抗性机理遗传的认识不尽相同，但是人们对抗青枯病的斗争却一直在不断的探索中，总体上有以下几种方式：农耕措施，化学药剂，生物防治，现代分子生物学方法等。一些农业措施，如轮作、合理施肥、深沟窄畦、清洁田园等，均能在一定程度上减轻病害的发生，但是并不能从根本上控制病害。番茄青枯病菌能够随病株残体在土壤中越冬，而且能存活1-6年，在田间主要通过降水和灌溉水传播，人畜、带菌土壤、农具、昆虫等也能传播，因而易于引起重复感染，导致病害流行、蔓延。防治青枯病用的化学药剂主要是农用链霉素，作用效果一般。国内外至今从未发现对青枯病菌能免疫的番茄材料，对青枯病高抗性的番茄品种也很少。生物防治方法主要有利用青枯菌的无致病力菌株和拮抗

菌。通过诱变产生的无致病力的青枯菌突变株可以在番茄茎、叶等部位定殖，而它的定殖可阻止强致病菌株病菌的繁殖，从而起到抗青枯病的作用，从20世纪80年代以来，国内有不少学者也对此进行了研究，台湾Tsai等[6]、康耀卫等[7]、罗宽等[8]及董春等[9]利用60Co辐射、紫外线诱变、转座子诱变及自发突变体等方法获得了无致病力青枯菌，并且取得了一定的抗性效果。随着分子标记技术的快速发展和番茄基因连锁图谱的日趋饱和，番茄的一些重要病害的抗病基因得到精确定位，这不但可以为建立完善的番茄抗病基因的辅助选择体系提供可能，而且为分离和克隆抗病基因提供了可能。到目前为止，对两套材料发展的群体应用RFLP、AFLP、RAPD标记技术已鉴别出多个青枯病抗性QTL[10]，番茄抗病育种展现了广阔的前景。

受体蛋白激酶(Receptor Protein Kinase RPK)是动物细胞信号转导过程中重要的信号介导因子。随着拟南芥基因组的测序计划完成，发现在植物细胞中存在大量与动物细胞中受体蛋白激酶结构相类似的蛋白质，但是多数受体的功能尚不确定，故称之为类受体蛋白激酶(Receptor-Likekinase RLK)。RLK在植物中的作用现在了解的有：调控组织形成和器官发育、调控花粉自交不亲和、感受植物病原信号、参与抗逆性反应、参与胞内信号转导。

现在人们已经从拟南芥、水稻和小麦等高等植物中克隆出了大量的RLKs基因，发现它们对植物生长发育过程均起着十分重要的调控。如从拟南芥中获得的与抗细菌性叶斑病密切相关的FLS2基因；从水稻中获得的与抗白叶枯病相关的Xa21基因；从小麦中获得的参与抗白粉病反应的TaLRK基因等[11]。许多植物通过RLKs基因的可逆磷酸化参与抗病防御过程。一般都会经历3个过程：首先，病原信号分子(配体)与RLKs胞外结构域识别结合;其次，胞内激酶域发生磷酸化等反应将信号传递到下游靶基因;最后激活靶蛋白表达使植株产生抗性。植物会将染病的部位迅速进行PCD反应，可以有效地抑制病原菌的蔓延，另外也会产生H2O2、超氧阴离子自由基(O-2)、羟基自由基(HO.)和NO，可以直接杀死病原生物。同时凋亡细胞产生的新信号分子可以快速传遍整个植株，使细胞内水杨酸(SA)大量积累，其诱导的衍生物乙酰水杨酸（SAR），都可使植物的整体抗病水平提高。

本研究的主要内容是将辣椒中的RLK基因（CaRLK）转入番茄中，以期使番茄获得更好的抗逆性，从而可以抵抗番茄青枯病。通过转基因的方法获得抗病性可以克服远缘杂交不亲和的弊端，在较短的时间内获得所需性状的植株。本文主要通过分子生物学的方法来鉴定CaRLK基因转入番茄和表达的情况，通过特异引物的PCR可以检测该目的基因是否顺利被转入番茄中以及该基因是否能够被顺利遗传；通过特异引物的RT-PCR可以检测该目的基因在番茄植株内是否顺利被转录，即检测该基因的表达情况。材料与方法

1.1 研究材料

原始材料为经过转RLK基因操作的三种番茄的T1代种子若干，分别为D-RLK-2、D-RLK-

6、D-RLK-10（以后文中简记为2、6、10号）。1.1.1 温室栽培植株

取三种番茄种子各5粒，洗净后经水培催芽后播种于花盆中，置于温室中培养。1.1.2 组织培养植株

1.取三种番茄种子各4粒，用无菌水浸泡30min。2.75%酒精消毒30S，用无菌水清洗3次，每次2min。3.25%NaclO消毒10-12min。用无菌水冲洗5次，每次2min。4.取出种子，将其播种于1/2NH4+培养基中，组培室中培养。5.种子发芽后，待下胚轴长至六厘米左右时继代培养。1.2 研究方法

1.2.1 转基因番茄植株的生长状况

记录转基因番茄种子的发芽情况，以及植株长成后叶片的形状、株型等性状，与普通植株的生长状况相比较，记录数据并及时拍照。1.2.2 PCR鉴定

1.2.2.1番茄基因组DNA的提取与检测

采用改良的CTAB法提取番茄的基因组DNA：

1.取0.2-0.5g幼叶用液氮磨成粉末，迅速转入1.5mL 离心管中，在离心管中事先加入少量PVP和30uLβ-巯基乙醇；

2.向管中加入700uL65℃预热的CTAB抽提液，盖严后迅速轻轻摇匀； 3.将离心管于 65℃水浴45min，中间每隔10分钟左右颠倒混匀 3-4 次；

4.取出离心管冰上冷却后加入等体积氯仿/异戊醇（v：v=24：1），轻轻颠倒混匀，冰上放置10min；

5.室温下12000rpm离心10min； 6.吸取上清于另一离心管中；

7.加入等体积氯仿/异戊醇（v：v=24：1），轻轻颠倒混匀冰上放置10min； 8.12000rpm室温离心10min； 9.吸取上清于另一离心管中；

10.加入预冷的2/3体积的异丙醇，在-20℃ 温度下静置2-2.5h； 11.12000rpm 4℃离心5min，倒弃液体； 12.沉淀用75%的酒精冲洗2次；

13.沉淀于室温下晾干或于超净工作台中吹干，至到无异味； 14.加入50uL灭菌重蒸水溶解DNA；

15.加RNA酶 1μL 4℃过夜或者37℃水浴1小时； 16.溶解后，DNA保存于-20℃冰箱中。

常规琼脂糖凝胶电泳方法：

1.称取0.12g的琼脂糖，置于三角瓶中，加15mL 1×TBE作为溶剂;2.于微波炉中加热至沸腾，使琼脂糖完全溶解;3.将样品梳子插入胶槽，胶槽置于水平台上;

4.待胶液冷却到65℃左右时，加入0.5uL的溴化乙锭，使其最终浓度为0.5g/mL，将琼脂倒入胶槽内；

5.当凝胶至完全冷却凝固后，小心拔出加样梳，将胶槽放入电泳槽中，样品孔在阴极端；

6.向电泳槽中加入缓冲液(1×TBE)至没过胶面约1mm；

7.取5uL样品和2uL Loading Buffer(溴酚蓝)混匀，用移液枪加入样品槽中，Marker点加的是20000bp的λ-EcoT14Ⅰdigest；

8.加样完成后，合上电泳槽盖，接通电源控制电压在100V，电泳 20min；

9.当Loading Buffer（溴酚蓝）移到距点样孔约4cm时，停止电泳； 10.将电泳后的凝胶置于254nm的透射紫外灯上观察电泳结果并拍照记录。1.2.2.2 PCR及检测

以待测番茄植株基因组DNA作为模板，以CaRLK-NC1354-1883作为引物，进行PCR 扩增。设立以ddH2O为模板的空白对照，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，以鉴定转基因植株。

PCR反应体系表1：

表1 PCR反应体系

溶液

体积

ddH2O DNA模板 10×PCR Buffer dNTP Primer mix Taq酶 Mgcl2 总计

11.5uL 1uL 2uL 2uL 2uL 0.5uL 1uL 20uL PCR循环的反应程序：94℃，5 min；94℃，15S，57℃，20S，72℃，40S；35循环；72℃，10min；4℃，取出。

取每种PCR产物5uL进行琼脂糖凝胶电泳，使用2000bp的Marker Dl2000TM，剩余产物保存于-20℃冰箱中。1.2.3 RT-PCR鉴定

1.2.3.1 番茄总RNA的提取与检测

1.匀浆处理：将幼嫩叶片组织0.1g在液氮中磨成粉末，在液氮未挥发干净时转移到离心管中，迅速加入1.0mL TRIzol；

2.用移液枪吸打几次以剪切基因组DNA，将匀浆样品在室温下（15-30℃）放置5分钟，目的是使核酸蛋白复合物完全分离；

3.加入200uL氯仿，剧烈振荡15秒，室温下放置3分钟；

4.12000rpm离心10min。样品分三层：底层为黄绿色有机相，上层为无色水相和一个中间固体杂质层，RNA主要在水相中；

5.把上清转移到新的离心管中，不能吸取任何的中间层物质。加入等体积的异丙醇，室温下静置5min；

6.12000rpm离心10分钟。离心前看不出RNA沉淀，只能看到管中透明度下降，离心后在管壁上和管底出现白色胶状沉淀；

7.小心移去上清，防止RNA的丢失；

8.用 70℅乙醇（用DEPC水配制）洗涤RNA沉淀两次。每次用大约700-800uL，然后12000rpm室温下离心3min；

9.室温放置干燥或超净工作台中吹干，大约5-10分钟即可，不可干燥过长时间，以防RNA难以溶解；

10.加入30uLDEPC-H2O溶解，用枪头吸打几次，55-60℃水浴放置10分钟使RNA 溶解。然后将RNA样品-70℃保存。

RNA的常规琼脂糖凝胶电泳与前面所述的DNA电泳方法一致，不过此次电泳不用点样Marker，电泳出现特定的三条亮带即可认定是RNA。1.2.3.2 反转录（RT）

此步骤的目的是获得所需目的基因的cDNA，操作步骤如下：

RT反应体系1如表2：

表2 RT反应体系1 溶液 RNA溶液 Specific primer B DEPC-H2O 总计

体积 4uL 1uL 6uL 11uL

将RT反应体系1混匀以后于72℃水浴保温10min，然后取出迅速放入冰里冷却。RT反应体系2如表3：

表3 RT反应体系2 溶液

体系1反应所得液

体积 11uL

Buffer dNTP RT酶 总计

4uL 4uL 1uL 20uL

将体系2混匀以后于42℃水浴保温60min，然后90℃水浴保温5min，取出后迅速转移至冰上。至此获得了所需的cDNA溶液。1.2.3.3 RT-PCR及检测

以所获得的cDNA为模板，以CaRLK-NC1354-1883作为引物，进行PCR 扩增，由于该引物序列与转入的RLK基因特异的序列互补，所以如果该基因已经表达，就可以获得相应的cDNA，经过RT-PCR后会扩增该片段，则琼脂糖凝胶电泳后出现特异的条带。RT-PCR反应体系如表4：

表4 RT-PCR反应体系

溶液 cDNA Specific primer A Specific primer B 10×PCR Buffer dNTP Taq 酶 ddH2O 总计

体积 5uL 2uL 2uL 5uL 8uL 0.7uL 27.3uL 50uL

RT-PCR反应的循环程序：94℃，5 min；94℃，30S；57℃，40 S；72℃，60S；35 循环；72℃，10min；4℃，取出。相对PCR程序各循环的时间稍加延长，防止反应不充分。

采用常规琼脂糖凝胶电泳，1%浓度琼脂糖凝胶，使用2000bp的Marker Dl2000TM。结果与分析

2.1转基因番茄植株的生长状况

通过温室栽培播种的种子的发芽情况和通过组织培养播种的种子的发芽情况的统计结果如表5所示：

表5 番茄种子发芽情况统计结果

编号

温室栽培播种数 温室栽培发芽数 组织培养播种数 组织培养发芽数 2号 5 3 4 4

6号 5 1 4 2

10号 5 2 4 3

从种子的总的发芽率来看，6号种子的发芽率要比其他两种低，在所播种的9粒种子中只有3粒顺利发芽长成植株。从两种培养方式的比较来看，通过组织培养的种子的发芽率要比直接在温室中培养的发芽率高。可能的原因有以下几种：转基因的操作已经影响到种子的发芽能力和对外界环境的抵抗能力；种子本身发育不够成熟，营养储备不充足，所以在培养基中更容易成活；所选种子的概率原因或操作问题。

有的转基因番茄植株在生长过程中也表现出与普通植株不同的性状，如初生的叶片畸形，过早的不恰当的分枝等。图1中2号番茄叶型正常，与之对比的6号、10号初生的叶都有不同程度的畸形，图中d是10号植株在幼苗时产生了异常的分枝，且分枝与主干相粘连，如图中箭头所指地方。但是不论初生叶型正常与否，三种番茄植株长大以后叶型均恢复正常，如图中g、e、f所示。

图12、6、10号三种转基因番茄生长形态学对比图

a：2号幼苗正常叶；b：10号幼苗畸形叶；C：6号幼苗畸形叶；

d：10号植株不正常分枝；g-f：三种番茄长大后正常叶型

2.2 PCR鉴定

2.2.1番茄基因组DNA的提取与检测

番茄基因组DNA提取过程中最常见的问题是褐化问题，在添加β-巯基乙醇之后情况会得到很大的改善，另外应注意的是取材的时候尽量取幼嫩的叶片。所提取的番茄基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，从图中可以看出，所提的DNA片段大小大约在20000bp，降解的比较少，质量较好，所以说所提取的DNA可以作为PCR的模板使用。

图2 番茄基因组DNA电泳图像

M： Marker：20000bp的λ-EcoT14Ⅰdigest;1、2、3号泳道代表2、6、10号材料

2.2.2 PCR及检测

经过PCR以及琼脂糖凝胶电泳以后，凝胶成像如图3所示，图中1、2、3号泳道代表2、6、10号材料，4号泳道是对照。图中可以看出，2、6、10号番茄均产生了特异的目的条带，片段大小在500bp左右，说明经过转基因操作的三种番茄目的基因都已经成功的转入体内，并且能够顺利的稳定遗传给后代，具有遗传的稳定性。上面提到的转基因番茄植株发芽率低的原因可能就是目的基因插入了植物的基因组导致产生了变异。

图3 转基因番茄特异引物PCR鉴定结果

Marker： 2000bp的DL2000TM

Lane1、2、3：2、6、10号材料；lane 4：对照

2.3 RT-PCR鉴定

2.3.1番茄总RNA的提取与检测

提取的总RNA经过2%浓度的琼脂糖凝胶电泳后的图像如图7所示，从图中可以看出，RNA的三条标志性亮带均出现，而且整个泳道中的非特异性的亮带很少，说明杂质很少，未受DNA的污染。由于RT-PCR最终需要的mRNA的含量很低，仅仅占到总RNA含量的5%，所以直接通过琼脂糖凝胶电泳的方式是不能直观的看到mRNA形成的亮带的，要通过对rRNA完整性的检测来判断所提取的总RNA的完整度。RNA电泳结果如图4：

图4 转基因番茄总RNA鉴定结果 Lane1、2、3：2、6、10号材料

电泳中所出现的各亮带是细胞中rRNA所形成的，图中28S、18S亮带比较清晰，5S亮带稍暗，这是由于植物细胞质中各种RNA的含量多少所导致的，但是三条带均存在证明总RNA的提取是成功的，所需要的mRNA也必定存在于总RNA溶液中，因而可以利用提取的总RNA进行RT与RT-PCR过程。2.3.2 RT-PCR及检测

经过RT-PCR后，0.8%琼脂糖凝胶电泳的图像如图5所示，图中可以明显看出6号番茄在500bp左右位置产生特异亮带，2、10号均无相应的条带出现。由于引物是特异的，扩增出来的亮带即为目的基因的条带。通过条带大小的比较发现，RT-PCR做扩增出来的条带与PCR扩增出来的条带大小是一致的，这说明首先6号番茄的RLK基因已经在植株体内表达。

2、10号未产生特异条带有多种可能：RLK基因虽然转入植物体中并能顺利进入后代，但并未实际表达，该基因处于沉默状态；提取的总RNA中有部分降解。

图5 转基因番茄RT-PCR鉴定结果

TM

Marker： 2000bp的Dl2000；

lane1、2、3：2、10、6号材料；lane 4：对照

3讨论

3.1 DNA提取中的常见问题

1.最好使用新鲜的植物材料，低温保存的样品材料不可以反复冻融。2.植物材料使用适当，细胞裂解适量，如果材料过多会影响细胞裂解，导致DNA量少；材料过少同样导致DNA量少，纯度低。3.液氮研磨时不能等到溶化才转移，应在解冻前加入裂解缓冲液。4.水浴保温时要定时摇匀，动作要轻，否则基因组DNA断裂。5.组织褐化主要是由酚类物质引起，可通过加入PVP或β-巯基乙醇来防止褐化。6.酒精洗涤沉淀后等酒精挥发，但是不能过分干燥。7.将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融，以减少降解。

3.2 RNA提取中的常见问题

1.RNA酶是导致RNA降解的主要原因，它广泛存在于人的皮肤和体液中（如唾液），所以操作过程中必须佩带手套和口罩，并尽量不说话。2.各种容器和仪器上都可能存在RNA酶，所以尽可能使用一次性的无菌塑料制品，否则容器需严格灭菌，并经过适当处理以消除RNA酶。3.细胞中的酚类物质在细胞破碎时，经过多酚氧化酶作用，被氧化成有色的醌类物资，会影响核酸的提取并且降低提取质量，在提取液中加入PVP和β-巯基乙醇对降低酚类的干扰会有所帮助。4.同DNA的提取过程一样，酒精洗涤之后干燥不可以进行过长时间。5.由于RNA比DNA更容易降解，所以通常要保存在-70℃冰箱中，并且尽量减少冻融。3.3 PCR与RT-PCR中的常见问题

1.PCR与RT-PCR操作都尽量在冰浴中，减少核酸的降解。2.蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制 PCR反应，在提取时应尽量去除。3.Taq 酶的用量要适当，一般是5U/uL，酶量过少会影响反应产量，酶量过多使反应特异性下降，扩增出非特异性的条带。4.根据待扩增片段长度而定延伸反应时间：在1 Kb以内的DNA片段，延伸时间 1min就已经足够，由于本RLK基因片段大小只有约500bp，所以延伸时间在40S左右即可。5.各

公司所提供的PCR Buffer不尽相同，浓度是一方面，另一方面有的Buffer是不含MgCl2的，在使用的过程中应注意识别，并且适当的更改体系的各种量。3.4番茄转基因植株的鉴定

转基因植物的鉴定可以通过多种方法，如形态学、生理学、分子生物学等。利用分子生物学的方法可以在植物苗期进行鉴定，所以可以节约大量的时间。常用的分子生物学鉴定方法有PCR、RT-PCR、Southern Blotting、Northern Blotting、Western Blotting 等。通过分子手段来检测基因转化的情况相比通过生理反应的手段可以节约大量的时间，并且可以做到非常高的准确度。利用PCR可以方便的检测目的基因在植株内的存在情况，RT-PCR可以检测目的基因的表达情况。实际上，利用PCR、RT-PCR和各种Blotting技术相结合会提高检测的准确率和可信度。

在PCR中凝胶电泳的结果条带与RT-PCR中的条带片段大小都是在500bp左右，说明目的片段进入番茄后能稳定的存在，目的基因作为外显子得到充分的转录。CaRLK得到表达后可能会对番茄的抗逆性起到积极的作用，对于青枯病的抗性大小还需要进一步的检测。同时，CaRLK的表达量，即该基因的mRNA的丰度也是会影响到抗性效果的。

分子生物学技术的快速发展为防治青枯病开辟了新的途径，虽然目前利用基因工程分子克隆技术防治青枯病还处于刚起步阶段，但相信随着技术的不断发展完善和深入，未来的前景是相当可观的。结论

从PCR电泳结果看来，三种转基因番茄D-RLK-

2、D-RLK-

6、D-RLK-10都已经成功接受外源CaRLK基因，由于初始材料是F1代的番茄种子，所以充分说明该基因是可以遗传给后代的。通过PCR扩增特异的RLK基因片段检测只能说明RLK基因在番茄植株中的存在与否，对于该基因在植株体内是否转录并且成功翻译还需要进一步的RT-PCR的操作。从RT-PCR的电泳图中可以看出，只有D-RLK-6扩增出了特异的条带，说明在D-RLK-6中转入的RLK基因已经成功的表达。另外两种未出现特异条带如果不是假阴性，可能的原因就是转入的RLK基因插入的番茄基因组的位置不恰当，或者其他的导致基因沉默的原因在起作用。

对于D-RLK-6而言，可以确定它已经将CaRLK基因表达，但是，基因表达的量还是不能确定的，另外，该基因的表达是否在实际应用中会达到理想的抵抗番茄青枯病的效

果还是未知数，如果想进一步的了解其抗性，可以通过测定下游产物浓度、人工感染的方式来检测。

致谢

参考文献：

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