学习做切片_组织学切片辅导

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形态学方法 免疫组织化学

实验对象：冰冻切片

步骤

1、室温下复温30min，0.01MPBS清洗5min×3；

2、加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100＋0.01MPBS 100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MPBS清洗5min×3；

3、5%小牛血清封闭1h0.01MPBS清洗5min×3；

3、加入用血清稀释液（牛血清白蛋白 1.00g＋0.01MPBS 100ml)稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MPBS洗5min×3；

4、加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MKPBS 100ml＋30%过氧化氢）30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3；

5、加入0.01MPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3；

6、加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次；

7、加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应；

8、梯度酒精脱水之后，封片，拍照。

细节将消除内源性过氧化物酶这一步放在后面，能避免双氧水对目的蛋白的影响

1）实验技术大类： 形态学

（2）具体实验技术名称： 冰冻切片

（3）实验对象： 脑组织

（4）简要实验步骤

1.经心脏生理盐水灌注取脑，对半切开，4%多聚甲醛浸泡固定（4℃）2.20％、30％蔗糖/0.1M PB溶液梯度脱水、直至标本在标本瓶中沉底。3.标本在30％蔗糖/0.1 mol/L PB溶液脱水至沉底后取出，滤纸吸干表面水分。4.标本经OCT包埋剂包埋，连续冠状位切片（5）我的经验或者心得体会：

1.脑组织相对于其它器官含水量尤其丰富，冰冻切片时冷冻的速度要快，冻结的速度越慢，冰晶形成越多。

2.切片时的温度很重要，对于一般的组织切片，切头最适宜的温度在-22℃左右，但脑组织不宜太低，温度设置为：切头温度-19℃，机身温度为-21℃。

3.包埋的时候要在冰冻切片机内操作。先预冷切片的底座，然后再将标本放在底座上预冷，由于标本表面含有水分，自然就会与底座粘紧。预冷至标本表面长白霜，所需时间长短不一，1cm³大小的标本，约需5min。

4.包埋时，由下到上，尽量均匀涂抹，不要留空隙，特别是底部，螺旋状向上盘旋。标本周围包埋剂的厚度在1-2mm之间，底部3-4mm为宜。

5.OCT包埋剂不能包的太多或太少。太多，切出来的脑组织切片容易卷曲；太少，容易卷曲之外，标本底部的包埋剂过少，会导致固定不稳，标本容易与底座分离 1）实验技术大类： 形态学

（2）具体实验技术名称： 冰冻切片裱片方法（3）实验对象： 组织切片

（4）简要实验步骤

将组织切片标本贴附于载玻片上

我的经验或者心得体会： 裱片常用有两种方法：

1.漂浮法。切出来的脑标本先转移到0.01mol/L的PBS中，然后在裱到载玻片上，此法需要的时间精力太多，标本容易在裱的过程中损坏。如果切片平面太多，则无法一一辨认清楚，更难以按切片的顺序连续裱片。

2.直接裱片法。一般的同学切下组织后，直接就拿载玻片往标本上面粘，结果很多都是皱巴巴的，不平整，根本无法进行后面的实验。我的经验是先在载玻片上要裱片的部位预先涂上0.01mol/L的PBS，掀起冰冻切片机中压片的挡板，迅速将沾有PBS的区域直接去贴切下的标本。可以观察到，切片像是受到一股吸引力一样，自动贴在载玻片上并且自然展开，遇到有小皱折的地方，可以用小毛笔，蘸少许PBS溶液，涂抹在标本上，由于上下均有一层PBS液，可以自由的移动到你想要调整的切片部位和形态。调整好后，扫掉多余的PBS液，晾干切片备用。

（1）实验技术大类： 形态学

（2）具体实验技术名称： 组织切片封片

（3）实验对象： 组织切片

（4）简要实验步骤

免疫组织化学或者免疫荧光染色后的切片最后的封片

我的经验或者心得体会：

无论是经脱水透明还是直接干燥的切片，最后都需要用中性树胶或者甘油封片。在封片时，为了避免组织被颗粒污染，尽量用新的或干净的棉签棒/玻璃棒，这样可以避免将桌上的粉尘带入到中性树胶或者甘油中，并最后带入切片中。另外在封片前尽量不要摇晃封片剂产生小的气泡。封片时可以将封片剂沿着盖玻片的边缘递成一条线，然后将切片先垂直靠近载波片滴有封片剂的一边，慢慢倾斜45度左右，可发现载波片与盖波片慢慢的合在一起，最后轻轻的复位至垂直即可。

1）实验技术大类： 形态学

（2）具体实验技术名称： 冰冻切片保存（3）实验对象： 脑组织（4）简要 实验步骤

1.0.01MPBS及4%多聚甲醛经心灌注取脑，4%多聚甲醛4℃后固定过夜 2.30％蔗糖脱水两次、直至标本在标本瓶中沉底。3.OCT包埋切片

（5）我的经验或者心得体会：

1.第一次脱水时可以用30%的蔗糖，当组织沉底后，换第二次30%的蔗糖时，不要丢弃第一次的蔗糖，由于已经有组织内的水进入到蔗糖中去了，所以实际上蔗糖的浓度一定低于30%，可以将这部分糖收集起来作为下次沉糖的第一次脱水用糖，这样可以减少糖的耗费，对组织没哟任何影响。

2.为了减少冰晶的存在，在冰冻组织时，可以将经OCT包埋剂包埋好的标本放在一个小的塑料平皿中，倒入事先放置在-80度保存的2 甲基丁烷（不要蔓进组织就行），让组织速冻，可以减少冰晶，同时也可以保持直接接触底座的组织底部平整，并减少修组织时的切片浪费。3.为了避免伤害切片机用的刀片，从-80度冰箱取出的组织需要先放置在冰冻切片机中复温半小时，以避免组织及包埋剂太硬而伤害刀片。

（1）实验技术大类： 形态学

（2）具体实验技术名称： 冰冻超薄切片裱片方法（3）实验对象： 组织切片

（4）简要实验步骤

将超薄的组织冰冻切片标本贴附于载玻片上

我的经验或者心得体会：

对于没有confocal的实验室，要想做出很漂亮的荧光双标图片，可以考虑将切片切得非常薄，最薄可以达到6-8微米，当然这也对贴片技术提出了挑战。

首先组织必须固定好，固定好的组织切成薄片不会散开，而固定不好的组织薄片很快就散开。建议对这种薄片，采取漂浮法来贴片，直接裱片容易不平整。切出的标本放入0.01mol/L的PBS中（注意不要有triton x-100）。陈放的器皿直径也最好要大一些。切片进入到PBS时要尽量的轻，尽量让组织薄片漂浮在水面，切不可将组织薄片插入到水面以下，甚至还搅几下，也就是说尽量得让组织薄片显示为展开的状态而不是折叠得很厉害的状态。贴片时，小心的用一个头上是弯勾样的玻璃棒挑出组织，手要轻，再小心的让组织漂在不含triton x-100 的0.01mol/L PBS中，尽可能的保持当时在陈放器皿中的状态，如果组织直接是展开的状态是最好贴的。如果组织有部分皱褶在上，可以先将没有皱褶的部分贴在玻片上，调整玻片的方向，利用玻片在提起来时产生的水流来帮助折叠的切片顺着水流方向铺平，当然如果折叠的部分是向下的，则可以在贴片的过程中轻轻的拨动玻片产生小幅度的水流，结合细尖的毛笔来帮助向下折叠的组织与原来接触组织脱离并随着水流铺平。

形态学方法 免疫组织化学

实验对象：石蜡切片

步骤：

①石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS冲洗3次，每次5 min。②组织抗原修复，修复完自然放置至室温。

③每张切片加1滴或50 μl过氧化酶阻断剂(试剂A)，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次5 min。④除去PBS液，每张切片加1滴或50 μl正常非免疫动物血清(试剂，室温下孵育10 min。

⑤每张切片加1滴或50 μl 0.1%的Triton X-100破膜，室温下孵育10 min。

⑥除去血清，每张切片加1滴或50 μl的一抗体(稀释浓度为1：100)，4℃孵育过夜。PBS冲洗3次，每次5 min。

⑦除去PBS液，每张切片加1滴或50 μl生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次5 min。

⑧除去PBS液，每张切片加1滴或50 μl链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次5 min。

⑨除去PBS液，用PBST溶液漂洗切片3次，每次10 min。

⑩除去PBS液，每张切片加2滴或100 μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察1～3 min。⑪自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝。⑫梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明。⑬中性树胶封固。⑭数码相机拍照保存。

一方面有人认为：5）我的窍门或者心得体会：以上我写的是常规的免疫组化的步骤，但其实我试过在苏木素复燃，氨水返蓝后不用再繁琐的进行梯度酒精脱水以及二甲苯透明的这些步骤，直接将玻片放在晾片板上自然晾干即可封片拍照观察，而且效果也很好，因为梯度酒精的作用就是脱水，跟你自然晾干作用一样；中性树胶里面本身就有二甲苯，因为在某种程度上可以起到透明的作用。这样一来，整个免疫组化每次就可以节省一个小时的时间了。大家可以试试看。有人提出了对上一位的看法：对这位兄弟的心得体会有点疑问，理论上来说你的窍门也不是不可行，但我觉得还是不严谨，我们做免疫组化脱水透明这些步骤加在一起也就20-30分钟，所以也不存在节省一个小时的问题。省掉脱水透明的步骤其实不利于片子的长期保存，如果仅仅是做实验留个照片的话也无所谓了，但如果是在医院的话也就不行了。晾得时间长了片子不好看，短了水分残留与二甲苯不相溶，整个片子就模糊了。中性树胶是用二甲苯溶的是没错，但每个实验室加的量是随意的，加的少的话透明不彻底，时间长了片子就不能看了。这个我是有教训的。所以个人觉得还是老老实实脱水透明吧，并不浪费时间，即使多花个几分钟那也是有好处的。呵呵，一家之言，欢迎讨论。

5）过程中需要注意的事项或技巧：

1.在进行第一步的脱蜡至水，其实最好先进行空白片的烘烤，把空白片放在58度左右的烤箱中进行烘烤，大概4~6小时，这样有两个目的：第一，可使玻片上的组织与玻片贴的更紧；第二，可以尽可能的除去玻片上的石蜡，这样就可减少后续染色过程中的非特异背景染色。

2.过程中的“用PBS冲洗3次，每次5 min”我见过有同学是用那种塑料的免疫组化盒子，然后把玻片放进架子上，用手拿着架子在免疫组化盒中进行不停得上下提拉，以达到充分漂洗的目的，这样效果会很不错，但太累人了，每一次都要不停得提拉15分钟。我的做法是，把放有玻片的架子放进免疫组化盒中后，再把免疫组化盒放在做WESTERN BLOT 的摇床上，调整适当的速度，这样放在架子上的玻片就会随着摇床的摇摆而来回摇摆，达到漂洗的目的。3.每次滴加试剂时尽可能的超出标本的边缘稍许，以防止边缘没有液体覆盖增加非特异染色；另外除去液体，继续滴加下一种液体时动作一定要快，不然也是会干片，增加非特异染色。4.抗原修复首选高压修复，效果最好。其次是微波修复。EDTA修复液效果最好，柠檬酸效果其次。

5.第四步中你可以看到，没有“PBS冲洗3次，每次5 min。”这样的说明，对了，这一步是达到用非免疫动物血清封闭非特异抗原的目的，如果你冲洗了，则整个实验就白做了，这一步切忌。6.如果抗原时表达在包膜的，则破膜与否不是太重要；但如果抗原是表达在胞浆的，则最好破膜。7.一抗孵育最好选择4度过夜，抗原抗体反应比较温和；

8.DAB染色时间把握，可以采取镜控。滴完DAB后迅速在显微镜下观察，最佳的时间点是，你要观察部位的胞浆出现了橙黄色，而其他背景还没有开始变黄。9.还是不用梯度酒精和二甲苯作用，直接晾干，封片，观察拍照。也有人认为：这位兄台说的大部分我都认同。有几点与你共同讨论

1..关于脱水透明的问题，在主题的其他贴里我表达了自己的观点，这里不累述。关于抗原修复的问题，有点不同看法。抗原修复不存在哪种方法最好，哪种方法其次的问题。每一张抗原都有不同的修复方法，有的高压修复做出来是阴性，但用胰酶消化就是阳性了。理论上即使两种抗原修复方法相同，例如都是微波修复，但作用的时间和方式可能也不一定一样。有点直接煮15分钟好，有点20分钟好，有的可能要每次煮5分钟，稍冷却再煮5分钟，重复好几次。具体的原理我也不是很明白，是实践经验的总结。关于破膜与否的问题，免疫组化切片一般就4各微米，细胞都已经被切开了，还用破膜吗？相反，如果你破膜时间和浓度掌握不好，可能还会造成染色定位不准。该膜阳性的弄成膜和浆都阳性了。如果你认为出现阴性是没破膜的话，个人感觉还是从其他方面找原因。当然，如果你做的是细胞爬片的免疫组化，那就需要破膜了。

形态学方法

载玻片处理（免疫组化用）实验对象：载玻片

（一）我们大学多个实验室用的载玻片处理方法：

1.普通的载玻片（例如： 帆船牌），将其排列在玻片架上，置于热水中，加洗衣粉，煮沸30分钟

2.倾去洗衣粉水，自来水冲洗2遍，把洗衣粉冲干净 3.超声清洗（65w，10min）4.酸缸内浸泡过夜

5.自酸缸内取出，自来水冲洗 6.超声清洗（65w，10min）7.双蒸水冲洗，烘干 8.75%酒精浸泡过夜 9.双蒸水冲洗，烘干 10.过明胶（3次）

（二）我改良的载玻片处理方法： 1.购买洁净度高的载玻片（例如：世泰）2.置架排列后，75%酒精中浸泡过夜 3.取出后，双蒸水洗涤，烘干 4.过明胶（3次）

我的窍门或心得体会：

1.经改良后的步骤简单快捷，节省大量时间。旧方法最起码要4天时间，新方法2天就完成了。当处理少量载玻片可能不觉得有多大差异，但如果你主要研究形态学的话，处理几百张载玻片的时候，就可以体验到这两种方法的差别。

2.很多人用多聚赖氨酸处理载玻片，个人觉得还是明胶可靠，很少掉片，比较过自己用多聚赖氨酸处理的载玻片或者是直接从公司购买的多聚赖氨酸处理的载玻片，都有不同程度的掉片现象，做石蜡切片的可能相对还好一些，但是冰冻切片，个人感觉明胶处理的的载玻片明显优于多聚赖氨酸处理的载玻片。并且，明胶经济实惠，非常便宜，而多聚赖氨酸很贵；过明胶可以用个大烧杯批量处理，过多聚赖氨酸的时候那可是细活。

（1）实验技术大类：分子生物学

（2）具体实验技术名称：western blot（3）实验对象：动物心肌组织/细胞蛋白（4）简要步骤：凝胶配置及蛋白样品前处理

（5）心得体会：

1．配胶: 该部分较为重要的是配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜。常出现的问题有：A.凝胶出现花纹：此时应检查原料中过硫酸铵（AP）粉末是否受潮

B.凝胶聚合时间较长：聚合时间由AP以及TEMED决定，通常在30min左右，AP不新鲜会导致聚合变慢：此外还需注意环境的温度也很重要，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加AP以及TEMED的量，但通常不会超过1h，若超过1h甚至更长仍未聚合，应检查配制的操作有无错误。

2．处理蛋白样品：该部分蛋白样品本身很关键，若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了；除此之外loading buffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时将样品与loading buffer混合均匀也应注意。详722926

见

：http://protein.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=15722926&sty=1&tpg=1&ppg=1&age=0#15

（1）实验技术大类： 免疫测定与诊断技术

（2）具体实验技术名称： ELISA（3）实验对象： 肿瘤病人血清标本

（4）简要步骤:① 包被：用包被缓冲液将MBP/OY-TES-1稀释至1.0µg/ml，取100µl/孔包被酶标板，4℃湿盒过夜。1×PBS-T洗板3次（室温静止30sec/次），甩去液体，用纸吸干； ② 封闭：5%脱脂奶（200µl/孔）37℃封闭30min，1×PBS-T洗板4次，甩去液体，用纸吸干； ③ 上血清：加入待检稀释血清（1:400）、阳性对照和空白对照各100µl/孔，37℃湿盒孵育1h，1×PBS-T洗板4次，甩去液体，用纸吸干；

④ 上二抗：加入Biotin-绵羊抗人IgG单克隆抗体（1:1000），37℃湿盒温育1h，1×PBS-T洗板4次，甩去液体，用纸吸干；

⑤ 上标记物：加入Avidin-HRP（1:1000），37℃湿盒温育30min，1×PBS-T洗板4次，甩去液体，用纸吸干；

⑥ 显色：TMB避光显色15min，加1N H2SO4终止反应； ⑦ 酶标仪OD450与OD630双波长读数。

（5）我的窍门或者心得体会：1.我没用试剂盒做（尚未有商业化试剂盒开发），所以一切数据都要自己计算，包括包被蛋白浓度，一抗浓度，二抗浓度，计算时务必不能出错，要不就会功亏一篑。

2.用任何试剂前都要把试剂混匀，因为蛋白是很容易沉淀的。3.用固定的几把移液器，这样可以尽可能的较少误差。

4.湿盒孵育前要先把湿盒放在37°进行温度平衡，这样可以减少达到平衡的时间，而且也可以避免符合试验温度的孵育时间不够。

5.等板底的水珠挥发以后再读数，要不会出现负值。

6.实验时尽量少开口说话（因为大部分做的是蛋白的测定，口水避免不了会使所测蛋白降解的啊，呵呵）