《分子生物学与基因工程》课程论文_基因工程课程论文
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植物基因工程研究进展
摘要：自1983年美国人首先成功地获得抗卡那霉素的烟草再生植株开始，人类就开始了植物基因工程的研究。至今已在逾200种植物中成功地获得了转基因植株,并有近1000例转基因植物获准进行田间试验,更有十余种转基因植物(如转基因棉花.大豆)已进入商业化种植.转基因产品已进入人们日常生活。植物基因工程的应用已进入蓬勃发展阶段。下面是我从植物基因工程改善生物质能利用的研究进展做一说明。
关键词：木质纤维素 细胞壁 水解酶
近几年来全世界对能源的需求量急剧增加加速了对有限的不可再生矿物质 能源的消耗资源的利用也增加了CO2及粉尘的排放,造成环境破坏和全球气候变 化[1]可再生的清洁的生物质能成为人们关注的热点。其中的燃料乙醇工业,近年来在世界范围内得到了广泛的发展,我国也大力支持发酵乙醇用作能源[2]。目前,绝大部分乙醇来源于玉米淀粉发酵生产。但是由于淀粉本身又作为食品和饲料,产量有限,成本较高,阻碍了乙醇工业的发展。于是,人们把注意力转移到谷物秸秆等廉价 的含有大量 的木质 纤维素 的生物质 材料上希望 能够被 充分利用 [3]。但由于木质纤维素本身难以分解,许多研究利用 基 因工程 方法 改善植物,使自生产生的多糖资源更利于降解,用于发酵产乙醇。1.木质纤维素发酵生产乙醇发展现状
在中国,大约每年会产生10t亿农林业废弃物这些资源用于造纸、纺织或者直接作为燃料这些占到很少一部分。绝大部分被废弃了木质纤维素是光合作用的基本产物 , 也是生物圈产生的最充足的可再 生生物资源被认为是地球上最丰富的生物高分子聚合[4]。
大部分的高等植物细胞壁由胶联多糖、糖蛋白和木质素组成双 子 叶植物 , 如拟南芥等,细胞壁多糖主要有三种:纤维素半、纤维素和果胶质,包埋在非 纤 维多糖基质(半纤维素和果胶)中的纤维素网络,与木质素和结构蛋白共同构成植物细胞壁的聚合液晶结构[5]天然状态下由于木质素的保护作用,阻碍了水解 纤维素酶与纤维素的接触并发挥作用,成为影响纤维素水解的重要因素 [3, 4]。YangB等人发酵降解实验证明,虽然半纤维素对纤维素。也有一定保护作用 , 但木质素的去除对于纤维素有效降解是最关键的[6]。一般对木质纤维素材料 的利用,首先要进行粉碎,然后预处理(酸碱处理等),最后 添 加 微 生物 来源 的纤维素复合水解酶类,使之与处理过的木质纤维充分接触,将其降解为单糖 , 从而用于乙醇发酵。现在虽然前期的粉碎和预处理工艺研究取得了很大进展但成本仍然较高，而且后期发酵分解处理。要添加来源于微生物的纤维素水解复合酶,价格仍十分昂贵[7]。这些因素导致目前用木质纤维素作为这些因素 导致 目前用木质纤维素作为原料发酵产乙醇,成本较高发展缓慢因此,现在对木质纤维素进行高效降解使用,仍然是个很大的难题。2.植物基因工程与植物木质纤维素利用
近年来随着生物技术的不断进步,人们开始尝试利用植物基因工程方法来 解决植物木质纤维素有效利用问题研究主要集中在改善植物细胞壁木质纤维素结构和含量比例等方面,使植物多糖资源利于降解使用，或者利用植物作为生物反应器,在植物内表达微生物来源的强活性纤维素降解酶,使植物自身表达高活性纤维素水解 酶类等研究。2.1 改善植物细胞壁的结构与组成过去几十年的研究,改善木质素含量及细胞壁已成为可能。利用基 因工程方法,控制植物内木质素合成相关基因的表达,可以改变木质素结构和含量木质素对纤维素形成的保护作用是导致 纤维素资源利用 的主要障碍,降低木质素含量或改变其结构,将利于纤维素 的分解[8]。虽然植物体木质素的合成过程还不是十分清楚,但近几年的研究,已使大量降低木质素含量成为可能。
在玉米和苜蓿的研究中发现,木质素合成单体之一的芥子醇, 其前体的甲基化合成酶基因COMT(caffeate/5-hydroxyferulate O-methyltransferase),如果被抑制表达,芥子单体含量会明显减少,可导致木质素含量降低 [9, 10]但是在杨树中抑制这种酶的表达却不能够改善材质,木质素含量反而增加[11]。Li L等人在杨树中研究发现,通过反义表达4CL基因(4-coumarate-CoA ligase)时,木质素含量了减少了约40%,并且导致10%的纤维素含量的增加，如果正义表达控制木质素组成单体紫丁香基丙 烷(syringyl)和愈疮木基丙烷(guaiacyl)比率的CAld5H基因(Coniferaldehyde 5-hydroxylase),可导致紫丁香基丙烷的量明显增 高,但木质素含量没有变化[12]。当两基因同时转化时,木质素含量减少可达53%,紫丁香基丙烷含量进一步增加,而纤维素含量能够增加30%。Cano-Delgado A等人研究拟南芥CESA3突变体发现,纤维素合成酶受损时,导致了木质素大量合成[13]这表明在植物木质部细胞中可能存在一种调控机制,当木质素含量减少时,为了维持支撑作用,纤维素含量会相应增加。Chabannes M等人在烟草中研究发现,同时抑制CCR(Cinnamoyl CoA reductase)和 CAD(Cinnamyl alcohol dehydrogenase)的表达,可大量减少木质素含量,但非预期 的还引起了细胞壁多糖酚类物质及可溶性酚类物质含量的变化[14]等人在番茄中抑制表达木质素合成相关的CCR基因,导致木质素含量降低,同时与木质素形成具有共同前体的酚类复合物增加[15]。Boudet AM等人通过抑制杨树木质素合成酶基因CCR,可导致植物细胞壁纤维 素成分更容易被纤维素分解菌Clostridium产糖量达到原来的2倍[16]这表明,降低木质素等物质含量后,非常利于纤维资源的利用。Li Y等人研究发现,过氧化酶影响了木质化过程[17]。Blee KA等人在烟草中反义抑制过氧化酶FBP1(French bean cationic peroxidase)同系物表达,在不影响植物生长发育的情况下,使木质素含量降低了40%~50% [18]。通过基因工程方法,改变木质素结构与含量的方法改善植物细胞壁结构,利于作为能源植物,具有重要的研究价值。
2.2 植物体内表达木质纤维素水解酶
过去几十年的发展,植物已成功的作为重组蛋白表达的生物反应器,它相对于微生物和动物表达的优势是具有较低的成本已在多种植物里面进行了异源重组蛋白的表达研究(如疫苗和工业用酶等),蛋白表达量高且保持了很好的生物学活性[19]。近几年,人们开始在植物体内进行微生物来源的研究,希望这些植物作为生物反应器,大量表达并在细胞内积累纤维素酶。收获的植物,经过粉碎和预处理(酸碱处理等)后,在分解过程中能利用自身表达的酶,不添加加来源于微生物的酶,就可以将纤维素充分分解为单糖, 进一步用于生产乙醇,降低生产成本(Sticklen M,2006)[20]。考虑到细胞质表达对植物生长影响较大,一般采用定向胞外或细胞器积累表达（如定向质外体叶绿体溶酶体等）Ziegler MT等人在拟南芥中,定向质外体,积累表达了来源于Acidothermus cellulolyticus的耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶(Endo-1,4-β-glucanase),表达量约达到叶子总可溶性蛋白的26%,并且保持了很好的活性[21]，同样是在拟南芥中,Hyunjong B等人定向叶绿体和过氧化酶体,积累表达来源于Trichoderma reesei的木聚糖酶(Xylase),达到了总可溶性蛋白的4.6%,明显 高于细胞质表达和单一细胞器定向表达[22]在烟草中Dai Z等人定向叶绿体,积累表达了A.cellulolyticu 的耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶,达到总可溶性蛋白的1.35%[23]。Dai Z等人采用同样的酶,比较了定向不同细胞器积累表达的差异,发现定向质外体表达蛋 白量最高,且保持了较好的活性[24]。在其它的植物中,也进行了相关的研究, Xue GP等人在大麦的胚乳中,特异表达来源于Neocallimastix patriciarum 的内切-β-1,4-葡聚糖酶,约达到了总种子蛋白的1.5%[25]。Oraby H 等人在水稻中,定向质外体积累表达了A.cellulolyticu耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶,达到了叶子总可溶性蛋白的 4.9%。
目前的研究集中于将植物作为生物反应器,尽可能多的表达并积累纤维素酶,用于后期的处理。在发酵分解过程可以利用植物自身表达的异源纤维素水解酶,节省了额外添加酶的量。表达 的大都是内切-β-1,4-葡聚糖酶或木聚糖酶,为了预处理后还 能保持较好活性,多采用稳定性强的耐高温酶。由于纤维素有效降解需要复合水解酶,并且木质素对其具有很强的保护作用,这些植物不会发生自身降解。3.前景与展望
利用不断发展的植物基因工程技术,在能源植物研究方面已经取得了不错的研究进展。但是,目前要实现廉价充分的利用纤维资源,还有一定的困难。通过对植物细胞壁合成 代谢研究的不断深入,应该能够获得对自身生长发育不影响的低木质素植物细胞壁木质素结构及含量改善纤维素含量增加,利于降解发酵产乙醇。还希望最终能够获得一种能源植物,这种植物通过自身表达异源的高活性木质纤维水解复合酶,酶的表达受到诱导调控,收获前诱导表达,收获后送往生物能源发酵工厂。这期间,木质纤维素多糖在植物体内也可进行持续降解,在发酵工厂只需添加一些简单的辅助分解酶就可以彻底降解掉,使木质纤维资源产乙醇变得十分简单 参 考 文 献: 1.Dorian JP, Franen HT, Simbeck DR.Energy Policy, 2006, 34 : 1984~1991.2.Yang B, Lu Y.J Chem Technol Biotechnol, 2007, 82 : 6~10.3.Himmel ME, et al.Science, 2007, 315 : 804~807.4.Ding SY, Himmel ME.J Agric Food Chem, 2006, 54(3): 597~606.5.Cosgrove DJ.Nat Rev Mol Cell Biol 2005 6 11 850~861.6.Yang B Wyman CE.Biotechnol Bioeng 2004 86 1 88~95.7.Kabel MA, et al.Biotechnol Bioeng, 2005, 93 : 56~63.8.Ragauskas AJ, et al.Science, 2006, 311 :484~489.9.Piquemal J et al.Plant Physiol 2002 130 4 1675~1685.10.Guo D et al.Transgenic Res 2001 10 5 457~464.11.Pilate G et al.Nat Biotechnol 2002 20 6 607~612.12.Li L et al.Proc Natl Acad Sci USA 2003 100 8 4939~4944.13.Cano Delgado A, et al.Plant J, 2003, 34(3): 351~362.14.Chabannes M et al.Plant J 2001 28 3 257~270.15.van der Rest B et al.J Exp Bot 2006 57 6 1399~1411.16.Boudet AM Kajita S Grima Pettenati J et al.Trends Plant Sci2003 8 12 576~581.17.Li Y et al.J Plant Res 2003 116 3 175~182.18.Blee KA, et al.Phytochemistry, 2003, 64(1): 163~176.19.Streatfield SJ.Plant Biotechnol J 2007 5 1 2~15.20.Sticklen M.Curr Opin Biotechnol 2006 17 3 315~319.21.Ziegler MT, Thomas SR, Danna KJ.Mol Breed, 2000, 6 : 37~46.22.Hyunjong B, Lee DS, Hwang I.J Exp Bot, 2006, 57 : 161~169.23.Dai Z, Hooker BS, Anderson DB, et al.Transgenic Res, 2000, 9(1):43~54.24.Dai Z, et al.Transgenic Res, 2005, 14(5): 627~643.25.Xue GP et al.Plant Cell Rep 2003 21 11 1088~1094.
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