表达蛋白常见问题_蛋白表达常见问题分析

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没有活性可能存在两种原因：his tag影响了活性，尝试切除his tag后再次测定酶活。如果目前载体上没有酶切位点可以更换至有酶切位点的载体（例如pET28a N段his tag可以使用thrombin切除his tag）。或者重新构建表达载体，自己引入酶切位点。如果切除了标签还是没有活性那就是蛋白本身的问题了。有些真核蛋白即使上清表达也是没有正确折叠的，或者没有进行表达后修饰，没有生物活性。这种情况就比较杯具了。

2楼说的包涵体，我觉得有可能，你的粗酶活性比较弱，产生包涵体之后就会更弱了。

当然到底是不是由于包涵体的原因，还得确定。

1.在N末端加入标签

这一系列载体的N末端加有标签，其中pQE-30、pQE-9带有6×组氨酸标签，pQE30系列中的三个载体的多克隆位点距离其实密码子而个相差一个碱基，pQE-9则是在多克隆位点处的设计较简单。PQE40则是带有6×组氨酸二氢叶酸还原酶标签（6×His-DHFR），对于比较难表达的蛋白以及蛋白太小容易被降解的蛋白可以利用这种标签。它可以保证蛋白的稳定性，同时不会对外源蛋白的免疫原性造成很大的影响，非常适合用于表位筛选。

2.在C末端加入标签

在蛋白的C末端加入标签的好处是显而易见的：可以利用基因本身的ATG作为起始密码子，保证了蛋白天然的N末端，这对于一些医药用的重组蛋白是相当重要的；同时可以纯化出那些完整表达的蛋白，一些在翻译过程中容易造成“暂停”现象的蛋白就不用怕纯化产物里含有不完整的产物。融合了6×组氨酸标签的有pQE-60和pQE-70，融合了6×His-DHFR的有pQE-16。