基因工程实验方案_基因工程实验指导

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实验

一、大肠杆菌质粒的提取与电泳检测

一、实验目的学习质粒DNA提取的基本原理，理解各种试剂的作用，掌握质粒最常用的提取方法，为基因工程提供载体原料。

二、实验原理

将一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖或表达的工具较载体。细菌质粒是重组DNA技术中最常用的载体。质粒是一种独立于染色体外的稳定的遗传因子，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞总，大小从1—200kb不等。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能复制，而宿主即使没有质粒也可以正常存活。但质粒的存在使得宿主细胞具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。常用的质粒载体大小在2.7—10kb之间。如pBR32、pUC系列、pGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。

细菌质粒的提取是根据环状质粒DNA分子具有相对分子质量小，易于复性的特点进行的。在热或碱性条件下DNA分子双链解开，若此时将溶液置于复性条件，由于变性的质粒分子能在较短时间内复性而染色体DNA不能复性。用碱变性方法提取质粒就是利用离子型表明活性剂SDS溶解细胞膜上的脂肪及蛋白，在pH高达12.6的碱性条件下染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，成了杂乱无章的片段。而相对分子质量较小的质粒 DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不完全分离，当pH4.8的NaAc或KAc高盐缓冲液调节pH至中性时，变性的质粒DNA可以完全形成互补链，又恢复到原来的构型。而染色体DNA不能恢复而形成缠连的网状结构，变性DNA与菌体的蛋白质凝聚成块。经过离心，出去的沉淀是变性的染色体DNA和蛋白质杂质，而上清液中的质粒DNA分子，则利用无水乙醇与盐凝聚形成沉淀。由于乙醇沉淀的时候，不光DNA还有性质相似的RNA也一起被沉淀下来。为了除去RNA，可以利用RNA酶进行处理，其后采用苯酚使RNA酶失活。出去RNA酶活性往往会采用一些复合物如苯酚、氯仿等，并且苯酚不仅使RNA酶失活，还能有效去除菌体的蛋白质等物质。因为只用无水乙醇沉淀，样品中还是混有蛋白质。所以为了获得高纯度质粒，应在无水乙醇沉淀前，先用苯酚进行处理，以便除去其中的蛋白质。

三、实验试剂

1.含质粒的大肠杆菌菌株

LB培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%Nacl、调pH7.2 抗生素：氨苄青霉素：母液100mg/mL，工作浓度100ug/mL 溶液I：50 mmol.L-1Tris-HCl，pH7.5，10 mmol.L-1 EDTA，pH8.0，高压灭菌后室温保存。

溶液II：0.2 M/LNaOH，1% SDS（以2M NaOH和10% SDS母液现用现配）溶液III：1.32 M KAc（pH4.8），(3mol/L NaAc)高压灭菌后室温保存。TE缓冲液（pH=8.0）：10mmol/LTris-Hcl/1mmol/LEDTA 2mg/mLRNase A溶解于10mmol/LTris-Hcl(pH7.5)、15mmol/LNacl 3mol/LNaAc(pH5.2 苯酚/氯仿/异戊醇（PCI）、冰冷无水乙醇、冰冷70%乙醇 碱裂解法小量提取质粒DNA步骤如下：

（a）挑单菌落接种于含相应抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜。（b）每管取1ml菌液然后12,000 g离心30 秒，集菌。（c）加200 l溶液I，用振荡器剧烈振荡悬浮菌体。（d）加300 l新配制的溶液II，温和颠倒混匀5次以上。

（e）溶液澄清后立即加入300 l预冷的溶液III，混匀后冰上放置5分钟。（f）4℃、12000 g离心10（或5）分钟。

（g）取上清，加入等体积的氯仿，颠倒混匀后，4℃、12000 g离心10 分钟沉淀蛋白。

（h）吸取上清，加等体积异丙醇，混匀。室温放置10分钟。

（i）12000 g离心10 分钟，弃上清，再用75%(v/v)乙醇洗涤沉淀，12000 g离心5分钟。

(k)沉淀在37 ℃干燥后后溶于适量水或TE（50ul），（-20°C）保存备用。质粒DNA的检测:取5ul的质粒与2ul的6×上样缓冲液混合后，在0.7%凝胶上电泳检测。

溶液I：50 mmol.L-1Tris-HCl，pH7.5，10 mmol.L-1 EDTA，pH8.0，高压灭菌后室温保存。溶液I的作用：

１、任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此可用适当浓度和适当pH值的Tris-HCl溶液。

２、大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。

溶液II：0.2 M/LNaOH，1% SDS（以2M NaOH和10% SDS母液现用现配）用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。

既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，溶液III：1.32 M KAc（pH4.8），(3mol/L NaAc)高压灭菌后室温保存。加入溶液III后出现大量沉淀，这与SDS的加入有关系。这其实是十二烷基硫酸钠遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potaium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。

琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带。其实这三条带以电泳速度的快慢排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。

实验

二、DNA片段（PCR或者酶切）的体外连接感受态细胞的制备重组质粒的转化阳性克隆的筛选（抗性筛选、蓝白斑筛选）

大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）

此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增。1.取1.5ml细菌培养物于EP管中，4000rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉 淀尽量干燥；

2.将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100µl 溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTApH8.0，25mmol/LTris-HClpH8.0)中，剧烈振荡；

3.加入200µl 新配制的溶液II(0.2mol/LNaOH，1％SDS（m/v）)，盖紧EP管 口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液 II接触，不要涡旋，置于冰浴中；

4.加入150µl预冷溶液III(每100ml的溶液III中含60ml5mol/L乙酸钾，11.5 ml冰乙酸，28.5mlH2O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠 的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5分钟； 5.在最大转速下离心5min，取上清液于另一新EP管；

6.用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，最大转 速离心5分钟；

7.小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽；

8.加1ml70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将 开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见的液体存在（5～ 10分钟），用适量的ddH2O溶解；

9.用0.5µl的RNase37℃温育5~10分钟； 10.电泳鉴定。

乙醇沉淀DNA 1.加入1/10体积的乙酸钠（3mol⁄L，PH=5.2）于DNA溶液中充分混匀，使其 最终浓度为0.3mol⁄L；

2.加入2倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃中15~30分钟； 3.12,000g离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；

4.加入1/2离心管容量的70％乙醇，12000g离心2分钟，小心移出上清液，吸 去管壁上所有的液滴；

5.于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干； 6.加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。

酶切

1.酶切前确定待切样品的浓度, 并选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。2.在离心管中加入如下成分： 10×Buffer 1μl 待切样品xμl 酶 0.5-1μl 加水补足10μl 3.混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。

4.将离心管置于37℃中温育1-3hr，若待切样品为PCR产物，则可将反应时间 适当延长。

5.用未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。注：当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比例适当加大反应体积。双酶 切可选用二者活性都较高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反应。）

连接

1.连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。2.在离心管中加入如下成分： 10×连接Buffer1μl 待连接的样品（胶回收产物或PCR产物，载体与片段的mol比为1∶3-5）连接酶0.5-1μl 加水补足10μl 3.混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。

4.将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间（根据不同公司的酶的要求 而定，一般为22℃1-3hr或16℃连接过夜）。

连接完的样品可直接用于转化，也可放4℃冰箱短期保存。

感受态细胞的制备

1.挑取适当菌株的E.coli单菌落接种于2mlSOB培养液中，37℃摇床过夜。2.取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50mlSOB中，18℃剧烈震荡，直到A600 达到0.6。

3.将培养物转移到50ml离心管中，4℃4,000rpm/min 离心10min。同时在冰浴 上配置TB溶液。

4.弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。

5.取1ml刚配的TB溶液打散菌体沉淀，再加入15mlTB（1/3体积的起始培养 液），冰浴10-15min，4℃4,000rpm/min 离心10min。

6.弃上清，沉淀重悬于4mlTB（1/12.5体积的起始培养液），冰浴10min。

7.加入280μl DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴10min。8.将菌液分装于EP管中，-80℃或液氮冻存。

9.取两管感受态细胞分别加入1μl无菌ddH2O（阴性对照）和1μl纯质粒（阳性对照）进行转化（见后），以检测感受态的质量。阴性对照平板上应该无菌落 生长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。

注：上述溶液均需高压蒸汽灭菌处理 0.1MK-Pipes(pH=6.7)的配制：

称取3.02gPipes粉末溶于80mlddH2O中，此时粉末不能完全溶解，用10N KOH或KOH固体调节PH值，只有当PH接近6.7时粉末才能完全溶解，此时 当小心少量地加入KOH直至达到所需PH值。

转化

1.取100μl感受态细胞于冰浴上融化。

2.加入1μl纯质粒或连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30min。3.将菌液放入42℃水浴中热激90秒，立即放入冰浴中2min。4.加入0.9mlSOC，于37℃恒温摇床上200rpm×1hr温育。

5.将菌液4000rpm/min离心3min，留200μl上清将菌体打散，均匀涂布于含适当

抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃倒置培养过夜。

i.注：新倒的平板可于37℃培养箱中预先放置数小时至过夜干燥。ii.当转化的是TA克隆连接产物时可在菌液中加入8μl 1MIPTG 和40μl 20mg/mlX-gal以进行蓝白斑筛选。

重组子的筛选和鉴定

重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用扩增引物通过PCR进行鉴定，阳 性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的PCR产物。

1.用牙签挑取平板上的菌落接种于2ml含适当抗生素的LB培养基中，37℃摇 床培养过夜。

2.次日取菌液0.2-0.5ml，13,000rpm×3min离心，弃上清，加入20μl ddH2O和 20μl 酚/氯仿，震荡混匀，13,000rpm×5min离心。

3.取上清进行琼脂糖电泳，加入载体质粒DNA作为阴性对照，根据质粒大小 初步筛选重组子，重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。4.用碱法小量制备可能是重组子的质粒DNA。

5.选取适当的酶，对重组子进行酶切分析，酶切体积均为10μl体系。酶切样品 进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。

6.酶切分析正确的重组子分成两份，一份进行测序反应，另外一份保种。7.若用PCR法鉴定，则在第2步时每个样本取0.5-1.0μl 菌液为模板进行PCR 反应，每管反应体系最低可少至10μl，PCR产物电泳，能得到所需条带的样 本进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。