基因工程论文_大学基因工程论文
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基因工程基本条件分析报告（载体）
一、基因工程载体的定义
在基因工程中，通常是把外源DNA片断利用运载工具送入生物细胞。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做载体(Vector)。
二、基因工程载体必须具备的基本条件
1.具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 3.长度尽可能小，以提高其载装能力
4.具有多种单一的酶切位点，容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。
5.具有合适的选择性标记，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。
三、载体类型
载体的分类：
1.根据来源和性质分类：质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、噬菌粒载体、病毒载体、人工染色体载体。
2.根据功能和用途分类：克隆载体、表达、测序、转化、穿梭、多功能载体
四、常用主要载体分析
一、质粒载体
质粒作为一种裸露的，比病毒更简单的，有自主复制能力的DNA分子，是处于生命与非生命的分界线上。
(一)质粒的一般生物学特性
质粒（plasmid)是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子，它广泛存在于细菌细胞中。在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。目前对细菌质粒研究的较为深入，在基因工程中，多使用大肠杆菌质粒为载体。
质粒分子的大小为1~200kb，质粒和病毒不同，它是裸露的DNA分子，没有外壳蛋白，在基因组中，也没有溶菌酶基因。质粒可以′友好”的“借居”在宿主细胞中，也只有在宿主细胞中，质粒才能完成自己的复制。同时将其编码的一些非染色体控制的遗传性状进行表达，赋予宿主细胞各种有利的表型。
1．质粒的类型
大肠杆菌中现已找到许多类型的质粒，其中对F质粒，R质粒和Col质粒研究的较为清楚。由于这些质粒的存在，寄主细胞获得了各自不同的性状特征。简介如下：
①F质粒：又叫F因子或性质粒(sex plasmid)。F因子是雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的F—细胞则叫做雌性细胞。F+细胞的表面可以形成一种叫做性须(pilus)的结构，它促进雄性细胞同雌性细胞进行配对。
在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培养，由于性须的作用，就会形成雌—雄细胞配对。我们称这种过程为细菌的接合作用(conjugation)。在雌雄细胞配对期间，雄性细胞中的F因子按滚环复制模式，经性须作用进入到雌性细胞。配对之后F—受体细胞获得了F因子，也变成为F+细胞。
②R质粒：也称抗药性因子。R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力
③Col质粒：此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种毒性蛋白，它可以使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。
2．质粒的复制类型
一种质粒在一个细胞中存在的数目，称为质粒的拷贝数。根据宿主细胞所含拷贝数的多少，可把质粒分成两种不同的复制型。一种是低拷贝数的质粒，称“严紧型”复制控制的质粒(stringent plasmid)，此类质粒每个宿主细胞仅含1~3份的拷贝。另一类是高拷贝数的“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)，这类质粒每个宿主细胞可达到10~60份拷贝。
一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并不是绝对的，这往往同宿主的状况有关。同一质粒在不同的宿主细胞中可能具有不同的复制型，这说明质粒的复制不仅受自身的制约，同时还受到宿主的控制。
在一般情况下，质粒的接合转移能力与复制型及分子大小间有一定的相关性。现归纳如下：
分子量大
分子量小
接合型质粒
拷贝数少
非接合型质粒
拷贝数多
严紧型复制
松弛型复制
3．质粒的不亲和性
在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存，这一现象称为质粒的不亲和性(plasmid incompatibility)，也称不相容性。例如colEI派生质粒，它们之间是互不相容的，也就是说，这些亲缘关系较近的不同质粒，当两种进入同一细胞后，必定有一种在细胞的增殖过程中，被逐渐排斥(稀释)掉。称这些质粒间是不相容的。
彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群Gneompatiblity group)。而彼此能够共存的亲和质粒，则属于不同的不亲和群。大肠杆菌质粒现已鉴别出25个以上的不亲和群。它们之间是相容的，而同一个不亲和群内的质粒是不相容的。
(二)作为质粒载体的基本条件
以上讨论的都是天然质粒，天然质粒的研究在理论上和遗传学等方面作出了贡献，但它很难直接作为基因工程的运载体应用。质粒载体绝大多数是以天然质粒为基础，人工改造和组建形成的实用载体。可根据不同的实验要求，加以选择。
作为理想的质粒载体，应具备以下几个条件：(1)能自主复制，即本身是复制子
(2)具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；
(3)在基因组中有1~2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。
(4)分子量要小，多拷贝，易于操作。
二、大肠杆菌质粒载体
1．质粒pBR322质粒
质粒pBR322是经人工构建的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体，亦是应用最为广泛的克隆载体，利用pBR322曾克隆到多种基因，虽然现在已有多种具有更优良特性的新型克隆载体逐渐代替了pBR322在基因克隆中地位，但pBR322仍是人工构建的具有几乎所有的理想特性的基因克隆载体之一。
（1）pBR322质粒的结构
从pBR322质粒的构建过程，可以知道它是由三个不同来源的部分组成的，第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）； 第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；
第三部分来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。（2）pBR322质粒载体的优点
第一、具有较小的分子量。为了方便起见，大家统一规定pBR322质粒DNA分子核苷酸的计数从EcoRI限制酶的识别位点开始，并公认该序列…GAATTC…中的第一个T为核苷酸1，然后沿着从tetr基因到ampr基因按顺时针方向顺序计数。因此pBR322质粒DNA分子的正确长度是4363bp。
第二、具有两种抗菌素抗性基因可供作挂化子的选择记号。
第三、具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积1000~3000个拷贝。这就为重组体DNA的制备提供了极大的方便。
2．pUC质粒载体
pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5′—端带有一段多克隆位点的lacZ′基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。
(1)pUC质粒载体的结构
典型的pUC系列的质粒载体，通常包括如下四个组成部分：（1）来自pBR322质粒的复制起点(ori)；（2）氨苄青霉素抗性基因(ampr)，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；
(3)大肠杆菌β—半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α－肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因；
（4）位于lacZ′基因中的靠近5′端的一段多克隆位点(MCS，multiple cloning sites)区，但它并不破坏该基因的功能。
（2）pUC质粒载体的优点
与pBR322质粒载体相比，pUC质粒载体系列具有许多方面的优越性，是目前基因工程研究中最通用的大肠杆菌克隆载体之一。其优点概括起来有如下三个方面：
第一、具有更小的分子量和更高的拷贝数
在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多，如pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp。同时，由于偶然的原因，在操作过程中使pBR322质粒的复制起点
内部发生了自发的突变，导致rop基因的缺失。由于该基因编码的共63个氨基酸组成的Rop蛋白质，是控制质粒复制的特殊因子，因此它的缺失使得pUC质粒的拷贝数比带有pMBl或ColEl复制起点的质粒载体都要高得多，平均每个细胞即可达500~700个拷贝。所以由pUC质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆DNA分子。
第二，适用于组织化学方法检测重组体
第三，具有多克隆位点MCS区，方便简洁，节省时间。
pUC质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。因此，克隆在MCS当中的外源DNA片段，可以方便地从pUC质粒载体转移到M13mp8载体上，进行克隆序列的核苷酸测序工作。同时，也正是由于具有MCS序列，可以使具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHI)的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUC质粒载体上。
（3）pGEM系列载体
pGEM系列载体是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体。在其总长度为2743bp的基因组DNA中，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ′基因。在后者还插入了一段含多个限制性内切酶的识别序列的多克隆位点。此序列结构几乎与pUC克隆载体的完全一样。
三、λ噬菌体载体
l．λ噬菌体的一般生物学特性
λ噬菌体为线形双链DNA分子，长度约为49kb，在λDNA分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端，当λ噬菌体进入细菌细胞后，其DNA可迅速通过粘性末端配对而成双链环状DNA分子，这种由粘性末端结合形成的双链区域称为cos位点。λ噬菌体是一个温和噬菌体，其生活周期有二种不同的类型，即裂解周期和溶源性周期。在裂解周期中，λ噬菌体的DNA分子一旦注入寄主细胞中，便可借助于寄主的复制和转录系统的功能，使自身DNA大量复制同时合成大量的外壳蛋白，并组装成大量(约100个)完整的噬菌体颗粒，最后，使宿主裂解并从细胞中释放出来。
2．λ噬菌体载体
（1）改造
野生型的λ噬菌体不适于直接用作基因克隆的载体。主要原因有二：
①λDNA基因组大而且复杂，特别是其中具有许多基因克隆常用的限制酶识别位点(如5个BamHI位点、6个BglⅡ位点和5个EcoRI位点等)；
②λ噬菌体外壳只能接纳一定长度(即相当于入基因组大小的75％~105％)的DNA分子。因此，λDNA只能作为小片段外源DNA分子(即2.5kb左右)的克隆载体。这一克隆容量显然不能满足大多数基因克隆工作的要求，必须对野生型λDNA进行改造。
（2）类型：
只具有一个限制酶位点可便于外源DNA插入的称为插入型载体，含有二个限制酶切点，在两个位点之间的DNA区段可以被外源DNA片段所取代的载体称为取代型载体。
随着体外包装技术和寡聚核苷酸合成技术的发展，人们已经构建了许多带有
多克隆位点的λ噬菌体载体，现在常规使用的λ噬菌体载体，不少既可用作插入型又可用作臵换型。总之，多克隆位点的引入不仅极大地扩展了λ噬菌体的克隆范围，同时还大大地简化了其操作技术。
3．λ噬菌体载体的主要应用
（1）基因组DNA文库的构建；（2）cDNA文库的构建
（3）大容量载体(如粘粒等)中增殖的大片段外源DNA序列的亚克隆等。
四、粘粒载体（柯斯质粒载体）
1．柯斯质粒载体的构建
λ噬菌体克隆外源DNA的能力，虽说其理论上的极限值可达23kb，但事实上较为有效的克隆范围仅为15kb左右。当然，在一般的情况下，这样大小的DNA片段已足够容纳一个完整的基因及其两端的侧翼序列(flankingsequence)。然而，大量的研究资料表明，许多基因的分子大小比正常预期的要大得多，有的可达35~40kb甚至更大。柯斯质粒，乃是一类由人工构建的含有且DNA的COS序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。它们兼具有λ噬菌体的高效感染能力和质粒易于克隆选择的优点，既能像质粒一样在寄主细胞内复制，也能像λDNA一样被包装到噬菌体颗粒中去。其克隆能力为31—45kb，而且能够被包装成为具有感染性能的噬菌体颗粒。
2．柯斯质粒载体的特点
第一，具有λ噬菌体的特性。柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对立噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。进入寄主细胞之后的柯斯质粒DNA分子，便按照λ噬菌体DNA同样的方式环化起来。但由于柯斯质粒载体并不含有且噬菌体的全部必要基因，因此它不能够通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。
第二，具有质粒载体的特性。柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此在寄主细胞内能够像质粒DNA一样进行复制，并且在氯霉素作用下，同样也会获得进一步的扩增。此外，柯斯质粒载体通常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重组体分子表型选择标记，其中有一些还带上基因插入失活的克隆位点。例如，在pHC79柯斯质粒基因组的PstI限制位点克隆，会导致ampr基因的失活；在BamHI和SalI限制位点克隆，又会造成tetr基因的失活。
第三，具有高容量的克隆能力。正如上面所述，柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和COS位点等三个组成部分，其分子量较小，一般只有5~7kb左右。因此，可以插入到柯斯质粒载体上并能被包装成立噬菌体颗粒的最大外源DNA片段，即柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右。这个数字比且噬菌体载体及质粒载体的最大克隆能力都要大得多。同时，由于包装限制的缘故，柯斯质粒载体的克隆能力还存在着一个最低极限值。如果用作克隆载体的柯斯质粒的分子为5kb，那么插入的外源DNA片段至少得有30kb长，才能包装形成具感染性的且噬菌体颗粒。由此可见，柯斯质粒克隆体系用于克隆大片段的DNA分子特别有效。
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