基因工程课程设计_基因工程试验设计

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RNA干扰研究进展

摘要 ：RNA干扰（RNAi）是广泛存在于真菌、动物、植物的一种自身调控机制，是双链RNA诱发的使同源mRNA高效特异性降解的基因沉默现象，也是近几年生命科学的研究热点，具有广泛的应用前景。本文主要介绍了RNAi的发现、作用机理和在各个领域的应用。关键词： RNAi；dsRNA；siRNA；RISC；基因沉默

Progre of the study on RNA interference Abstract: RNAi is somekind Self-regulatory mechanism which widely exists in epiphyte, plants and animals,it is a phenomenon of gene silencing induced by double strandRNA,and also is the hotspot on life science with a wide range of application prospects.This study aimed to introduce the discovery , Mechanism and the apply in some fields of RNAi.Key words: RNAi;dsRNA;siRNA;RISC;Gene silencing RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的导致同源mRNA高效特异性降解的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi)。RNAi是基因转录后沉默的一种方式，是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。

RNAi广泛存在于生物界，是生物体抵御病毒或其它外来核酸入侵以及保持自身遗传稳定的保护性机制。RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反应特征，反应中需要多种蛋白因子以及ATP的参与。RNAi在基因功能研究和基因药物应用具有广泛的前景。1.RNAi的发现历史

1990年，为加深矮牵牛花的紫色，Jorgensen等导入了一个强启动子控制的色素基因，可是结果与预期相反，许多花瓣颜色并未加深，反而呈杂色甚至白色，这是由于转基因和同源内源基因的表达都被抑制了，Jorgensen把这个现象命名为共抑制(cosuppreion)。

1995年，Guo等发现注射正义RNA和反义RNA均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理的解释。

1998年，Fire和Tabara首次将双链dsRNA—正义链与反义链的混合物注入线虫，结果表现出比单独注入单链要强得多的沉默，并且导致子一代同源基因的沉默，这也是人们第一次应用RNAi技术。

随后,Hammond还发现，不仅在线虫中，在果蝇的研究中同样发现RNAi，尽管采用能生产dsRNA的酵母喂食果蝇的实验以失败告终，但是通过显微注射或者通过基因枪将dsRNA注入果蝇胚胎中或者将带有反向重复序列的DNA导入果蝇中能够引发基因沉默。后来RNAi相继在锥形虫（trypanosomes）、涡虫(planarian）、水螅（hydra）、斑马鱼（zebrafish）、真菌（fungi）、植物以及小鼠等不同种属的生物体中得以发现。

2002年，Zernicka-Coetz等用双链RNA注射小鼠受精卵和着床前的胚胎，结果发现导入的双链RNA可以特异性地抑制C-mos（c-mos是莫洛尼氏鼠类肉瘤病毒癌基因的同源基因）、钙粘附蛋白（E-cadherin）和绿色荧光蛋白（GFP）基因的表达。JudyLiebem1an和Premlata Shankar首先向公众宣布了在动物中利用RNAi技术治疗疾病的研究进展。

由于Fire和Mello解释了先前Guo S等无法解释的基因抑制现象而于2006年被授予诺贝尔生理医学奖。2.RNAi的作用机制

目前有关RNAi在植物、动物、果蝇中的研究表明其大体分为起始阶段、效应阶段、循环阶段。

2.1起始阶段 2.1.1 dsRNA的形成细胞中dsRNA的形成是RNAi 的第一步。外源DNA、RNA序列均可引起细胞产生相应的dsRNA，dsRNA可以是一个RNA分子回折自身互补而形成分子内双链，也可以是分开的两个RNA分子互补形成的分子间双链。如基因组中DNA 反向重复序列的转录产物或者同时转录反义和正义RNA 或者病毒RNA 复制中间体以及以细胞中单链RNA 为模板由细胞或病毒的RNA 依赖的RNA 聚合酶(RdRp)催化合成dsRNA等。在线虫（c.elegans)可以直接注射dsRNA 或把线虫浸泡在含dsRNA 溶液中等方式引入外源dsRNA ,还可以通过喂养表达正义和反义RNA 的细菌获得dsRNA。

2.1.2 siRNA的形成和参与RNAi的蛋白因子

当细胞中的dsRNA扩增达到一定量时，dsRNA会在一种具有RNase Ⅲ样活性的核酸酶作用下加工裂解成21～23 nt（nucleotide）由正义和反义序列组成的小分子干扰RNA片段(small interferingRNAs，siRNA)，每个siRNA分子互补双链两侧3′末端具有2 nt的突出，5′端的磷酸基团会被一种特殊的激酶保护起来。

果蝇中RNase III 样核酸酶称为Dicer。Dicer 含有解旋酶(helicase)活性以及dsRNA 结合域。迄今为止已鉴定出包括Dicer在内的若干个与RNAi有关的蛋白因子。在果蝇（Drosophila melanogaster）RISC中，已知存在着称为Argonaute2(AGO2)的因子，AGO2蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失，也就是说AGO2是果蝇RNAi机制的必须因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性（slicer activity），RNAi机制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主导。另外，几个RNA解旋酶(RNA helicase)也被鉴定为参与RNAi机制的因子。

在秀丽隐杆线虫（C.elegans）的RNAi中必须的因子有EGO1。这是一种RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase)，植物中也存在该蛋白同系物。RNAi中RdRP是将标靶mRNA作为模板，以导入的dsRNA(或siRNA)作为引物合成RNA，在细胞内针对于标靶mRNA合成新siRNA的酶。这一反应在一些生物的RNAi中为必须，但RdRP活性在人和果蝇的RNAi中是非必须的，这说明在不同物种之间RNAi机制的基本框架虽然相同，但存在着微妙差异。2.1.3 siRNA的结构特点

已发现在拟南芥(Arabidopsis）、线虫（c.elegans）、裂殖酵母（charomyces）以及哺乳动物中也存在Dicer 同类物干扰性小RNA(small interfering RNA ,或short interfering RNAs , siRNA)是RNAi赖以发生的重要中间效应分子。

siRNA 是一类长约21～25 个核苷酸(nt)的特殊双链RNA(dsRNA)分子,具有特征性结构,即siRNA 的序列与所作用的靶mRNA 序列具有同源性，siRNA 两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基，此外,每条单链的3′端均有2～3 个突出的非配对的碱基。

The structure of siRNA 对于体外人工合成的siRNA 来说,其活性发挥完全需要其双链中与靶RNA 互补的一条链5′端磷酸化,有时也需要与靶RNA 序列一致的另一条链5′端磷酸化。5′端磷酸化的siRNA 其活性明显高于非磷酸化siRNA。

在果蝇胚细胞裂解物中,新生成siRNA 的磷酸化由一种能特异识别siRNA 的激酶催化生成,从而允许siRNA 参与多轮靶RNA 的裂解，该过程为ATP 依赖性。这种激酶能够区分

siRNA 5′-核糖和5′-脱氧核糖。siRNA 的结构特征,即长21～23 nt、双链的两端各有2 个突出的3′碱基，5′的磷酸化使siRNA 不同于其它小dsRNA ,这是细胞赖以区分真正的siRNA 和其它dsRNA 的结构基础, 特异性激酶只保持真正siRNA 的5′端磷酸化状态,而对其它dsRNA 不发生作用,从而保证只有真正的siRNA 才能进入RNAi 途径并引发靶mRNA 的裂解。靶RNA 中的裂解位点受siRNA 中互补链5′端序列的影响,该链5′端的额外序列将导致靶RNA 中裂解位点的改变,而3′端的额外序列对靶RNA 中的裂解位点无明显影响。因此,siRNA 5′磷酸可能充当靶RNA 裂解位点的一种分子参照。

Elbashir 等对果蝇胚细胞裂解物中siRNA 任意一条链或两条链同时进行2′-脱氧或2′-氧-甲基修饰,结果siRNA 不能介导RNAi ,但对siRNA 3′端多个碱基进行2′-脱氧核苷酸替代修饰时仍具有RNAi作用。siRNA 识别靶序列的过程虽然高度特异,但并非siRNA 中的每一个位点对靶序列的识别均具有同等作用，siRNA 双链中心的碱基错配将不能引发靶

RNA 的降解。

Boutla 等研究显示,不同的合成siRNA 可引发果蝇胚胎细胞的RNAi ,这些siRNA 的点突变仅使其基因沉默功能轻度下降,提示基因沉默机制虽然要求一定的序列特异性,但并不过分严格。2.2效应阶段

siRNA的反义链可指导形成一种核酸内切酶复合体，称为RNA induced silencing complexes(RISC)。RISC是由多种蛋白成分组成的，包括：内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA链搜索活性等，其第一个亚单位为siRNA。RISC可利用结合在其上的内切核酸酶活性切割靶mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而干扰基因的表达。线C.elegans 中的MUT7(一种RNase D 样蛋白)可能是一种3′5′-外切核酸酶。此外, PAZPPiwi 蛋白家族成员可能是RISC中的构成组分,如Arabidposis中的AGO1 ；N.Craa中的QDE2 ；C.elegans 中的RDE1 等,以上这些蛋白与翻译因子eIF2C 同源。最新的研究进一步揭示,ATP 在siRNA 介导的RNAi 中具有重要作用。较长dsRNA 向siRNA 的转变要有ATP 参与，siRNA 与蛋白因子形成一个无活性的约360 kD 的蛋白PRNA 复合体，随之, siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白PRNA 复合体(RISC),此步具有ATP 依赖性。

ATP 使siRNA 5′端带上磷酸分子,且对siRNA 的功能具有重要作用。上述过程中siRNA 双链结构解旋很可能是一种稳定的结构改变,因为siRNA 双链体与细胞裂解物、ATP 等孵育后再除去ATP 及其它辅助因子，引导RISC与靶mRNA结合时，siRNA 3′端倒数第2个碱基起的作用非常大，因此此处不能出现错配现象。2.3循环阶段

含有siRNA 的活性复合体仍能识别和切割靶mRNA 分子。siRNA 可作为一种特殊引物,在RNA 依赖RNA聚合酶(RdRp)作用下以靶mRNA 为模板合成dsRNA ,后者可被降解形成新的siRNA，新生成的siRNA又可进入上述循环。这种过程称为随机降解性多聚酶链反应(random degradative PCR)。新生的dsRNA 反复合成和降解,不断产生新的siRNA ,从而使靶mRNA 渐进性减少,呈现基因沉默现象。RdRp 一般只对所表达的靶mRNA 发挥作用,这种在RNAi 过程中对靶mRNA 的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能。每个细胞只需要少量dsRNA 即能完全关闭相应基因表达,可见RNAi 过程具有生物催化反应的基本动力学特征。siRNA特异性地与mRNA结合，siRNA作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶作用下通过类似PCR的扩增作用再次形成dsRNA，新的dsRNA又被RNAase样的Dicer内切酶切割产生次级siRNA，次级siRNA又可以进入下轮循环。3．RNAi的应用与相关讨论

RNAi 是植物、线虫、真菌、昆虫、原生动物以及动物的一种强有力的基因表达抑制途径,在生物体的发生发育及防御系统的构成等方面均具有十分重要的作用。已证实无脊椎动物和植物中的RNAi 机制可抑制侵入宿主体内的病毒和转座子(transposon),减弱和清除其基因毒性作用。在基因工程中将一转移基因导入植物细胞时出现的基因沉默作用也是宿主细胞的一种通过RNAi 机制实现的自我保护性反应。3.1 RNAi在动植物中的应用

目前尚不清楚RNAi 在哺乳动物系统中所起的作用。哺乳动物基因组常面临高负荷病毒和自私DNA(selfish DNA)的侵袭以及转录异常所带来的危害,对这些危及正常基因组完整性的因素来说,RNAi 可能是整个防御网络的重要组成部分。dsRNA 介导的特异性基因沉默作用也可能在哺乳动物基因表达的调控中起重要作用,例如X 基因的灭活等。总之,在动物和植物中RNAi 的功能之一是通过抑制生殖细胞中转座子的迁移和DNA 重复序列的积累来保持基因组的完整性和稳定性。3.2 RNAi的细胞毒作用

此外，RNAi 也可作为一种防御机制抵抗病毒感染，2001年，Tuschl等将siRNA导入到哺乳动物细胞中并由此解决了在哺乳细胞内导入长的双链RNA时引发的干扰素效应，由此拓展了RNAi在基因治疗上应用前景。

RNAi机制普遍存在于动植物，尤其是低等生物中。因此被认为是进化上相对保守的基因表达调控机制。一种假说为，RNAi机制是作为在RNA水平上抵御病毒入侵的防御机制而存在的。在病毒自身基因组所包含的，或在病毒复制过程中产生的双链RNA可以被Dicer识别，从而引起病毒RNA降解。但是许多病毒为抵抗宿主的RNA干扰机制，会产生抑制宿主RNA干扰的蛋白，以保护病毒基因在宿主体内的顺利复制。已经发现的可以抑制宿主RNA干扰的病毒蛋白有potyviruses编码的HC-PRO蛋白、马铃薯X病毒编码的Cmv2b蛋白、兽棚病毒编码的B2蛋白等。RNA干扰也是抑制破坏基因结构的一种DNA片段转座子活性的重要方式。转座子通常以逆转座的方式在基因组中扩增。在逆转座过程中产生的双链RNA分子可以被Dicer识别，从而被降解。3.3抗肿瘤方面的应用

肿瘤的发生是一种多基因协同作用的结果，利用RNAi技术可同时阻断多个癌基因的转录表达，从而有效抑制肿瘤的生长，达到治疗肿瘤的目的。

尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)是一种在肝癌细胞中高表达的蛋白，Salvi等用RNAi技术沉默肝癌细胞中尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)的表达，结果转染靶向uPA的siRNA的肝癌细胞其侵袭、转移和增殖能力显著下降。Pardridge等以人表皮生长因子受体(HEGFR)为靶点，应用RNAi技术干扰其表达从而抑制颅内肿瘤的生长。

肿瘤的生长具有血管依赖性血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的血管生长因子。Han等报道用RNAi技术研究分析了血管内皮生长因子(VEGF)5种同型异构体基因功能，进一步

对血管生成基因进行敲除治疗癌症，并显示了较好的治疗结果。

因此，用RNAi技术沉默肿瘤发生发展过程中过表达的癌基因可抑制肿瘤的生长。RNAi还可用于研究与肿瘤细胞生长分化相关的信号传导通路，并通过干扰细胞信号传导途径中关键蛋白的表达，达到抑制肿瘤生长的作用，为恶性肿瘤的基因治疗提供了新的技术方法。

3．4 RNAi在药物研究中的应用

利用RNAi能够特异高效地抑制基因表达,获得去基因功能表型,能够在短时间内大规模筛选靶点,从而实现了在细胞水平和动物水平筛选药靶和评定药靶。Hamamichi利用RNAi和基因敲除技术系统屏蔽帕金森病模型中将近900个候选基因和通路,找到了两个帕金森病遗传易感性位点和治疗靶点,从而为该疾病的治疗奠定基础。

RNAi在被广泛应用于功能基因组研究确定了大量潜在的药物作用靶点的同时,也被证实了其作为新一代基因治疗药物的可能性。2006年,美国Acuity制药公司生产的用于治疗湿性老年斑病变的RNAi药物—Bevasiranib在RNAi临床实验方面取得成功,它在疗效、安全性方面都优于常规药物。

目前,FDA已经批准Bevasiranib进入III期临床实验,而最终的试验结果将于2009年获得。

RNAi药物其他方面的应用,如治疗Huntington病和哮喘以及COPD也进入临床前研究阶段,但是RNAi药物仍存在如给药途径、使用安全性等方面的问题。

另外，发现RNAi机制中的相关一些因子如内源性双链RNA及蛋白因子可以在多种层次上对基因表达进行调控，其范围已经超越了PTGS（post transcriptional gene silencing），如RNAi机制同样参与了转录水平上的基因表达调控过程中。

从理论上讲，RNAi技术能选择性地沉默基因组中任何基因的表达。在实验室中，RNAi已经被广泛用来研究生命现象的遗传奥秘，特别是在哺乳动物中抑制那些无法敲除的基因的表达，已经发展成为研究基因功能有利的工具。与其他几种进行功能丧失的技术相比，RNAi技术具有明显的优点，它比反义RNA技术和同源共抑制更有效，更容易产生功能丧失,与造成的功能永久性缺失技术相比，RNAi技术更受人们青睐。而且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用，可以在发育的不同时期或不同器官中有选择的进行。4.展望

自从1998年Fire首次报导以来，RNAi研究迅猛发展，掀起了dsRNA介导的基因沉默作用分子机制及其生物学功能研究的热潮，使RNAi成为分子生物学领域最热门的研究课题之一。在美国《科学》杂志评出的2002年十大科技进展的排行榜中名列榜首。

由于RNAi干扰作用具有高效性和高特异性特点,能有效阻抑不必要或有害基因表达,对细胞及机体正常功能的发挥和维持至关重要。为多种病毒性或遗传性疾病以及肿瘤癌症等医学顽症的根治开辟了一条新的有效途径。RNAi不仅能大大推动人类后基因组计划的发展,还将应用于基因治疗、新药开发、生物医学等研究领域。因此,RNAi的研究与应用具有极其重要的理论和实际意义,将对医学生物学的发展产生深远的影响。

但我们注意到RNAi在其发展的过程中仍然存在许多问题需要解决，需要我们对它进一步研究和应用，并在生命的各个领域做出贡献。

参考文献：

[1]谭雪梅,羊云飞,孙国昌,等.RNA干扰(RNAi)的现象和作用机制以及在猪病防控中的应用[J].畜禽业,2007(2):4-5.[2]黄冰艳,吉万全,郭蔼光.转录后沉默(PTGS)及其在作物遗传改良中的作用[J].中国生物

工程杂志,2005,2(5):1-5.[3]韩蓓，王秀敏，顾学范．双链RNA干涉技术(RNAi)在不同生物中应用的研究进展[J]．遗传，2002,24(2):200-202．

[4]张彬彬．RNA干涉与基因沉默研究进展[J]．山东理工大学学报，2004,18(1):106-l10． [5]康洁，刘福林．RNAi生物体内的基因免疫[J]．生物学通报，2004,8(39):16-17． ［6］陈忠斌，于乐成，王升起.RNA干扰作用（RNAi）研究进展［J］.中国生物化学与分子生物学报，2002，18（5）：525-528.［7］李刚.RNAi研究现状与进展［J］.广东医学，2003，24（3）：327-329.［8］遇玲，李名扬，郭余龙.RNA干扰机理与应用［J］.安徽农业科学，2009，37（7）：2870-2872.［9］袁克华，冯仁军，程萍，等.RNA干扰的研究进展［J］.安徽农业科学，2009，37（8）：3471-3473.[10]陈忠斌,于乐成,王升启.RNA 干扰作用(RNAi)研究进展.中国生物化学与分子生物学报，2002 ,18(5):525-528.[11]王春蕾，赵博，丛斌.RNA干扰技术的应用现状及研究进展.农业科技与装备，2009，6（3）：183.[12]茂庆.蚊抗药性相关基因克隆与功能研究及用RNAi抑制蚊抗药性的初步研究[D].南京:南京医科大学,2005.[13]胡颖,洪蝶.RNA干扰机制的分子生物学研究进展[J].国际病毒学杂志, 2007, 6:185-189 [14]李曙芳,刘田福.RNA干扰技术的应用新进展.中国实验动物学报, 2009,17(1).[15]王猛,马艳平,陈豪泰,马丽娜,丁耀忠,杨生海,刘永生,张杰.RNA干扰技术应用的研究进展.江西农业学报,2009, 21(6): 108-111.[16]赵志荣,刘森.日本血吸虫Mago nashi基因RNA干扰系统的构建及鉴定[J].中国人畜共患病学报, 2006, 22(8): 746-749.[17]LIPARDI,WEI Q,PATERSON BM.RNAi as random degradative PCR:siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generate new siRNAs[J].Cell,2001,107(3):297-307.[18]Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R.A system for stableexpreion of short interfering RNAs in mammalian cells[J].Science, 2002, 296: 550-553.[19]Miyagishi M, Taira K.U6 promoter2driven siRNAs with four u-ridine 3′overhangs efficiently suppre targeted gene expreionin mammalian cells[J].Nat Biotechnol, 2002, 20(5): 497-500.