蛋白激酶在缺血大鼠海马神经元细胞中的保护作用论文_适应性细胞保护作用
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研究发现，缺血再灌注损伤是对组织造成损伤的主要因素，即再次恢复血液供应，缺血组织灌注时造成的微血管和实质器官的损伤，本研究旨在探讨糖皮质激素诱导的蛋白激酶1(SGK1)在大脑缺血再灌注过程中可能的保护机制。资料和方法
1.1 样本来源本研究用细胞为培养后的1 日龄SD 大鼠神经元细胞。对SD 大鼠采用椎脱臼处死法处死，用75% 酒精浸泡消毒3 ～ 5 min;取出海马神经元细胞进行培养。
1.2 试验方法
1.2.1 大鼠海马神经元细胞的额分离及培养选用1 日龄SD大鼠2 只。通过对大鼠进行消毒后处死，获取了SD 大鼠的海马细胞，并进行了体外培养。
1.2.2 已分离培养的SD 大鼠海马神经元细胞的免疫荧光鉴定采用海马神经元特异性抗微管相关蛋白2(MAP2)抗体免疫荧光来显示分离和培养的结果，在显微镜下计数，记录每个视野中染色阳性的细胞占所有细胞的比值，超过95%的为阳性。
1.2.3 通过氧糖剥夺诱导海马神经元凋亡将海马神经元细胞根据氧糖剥夺诱导时间不同分为正常海马神经元细胞组，氧糖剥夺诱导120 min 组、氧糖剥夺诱导120 min 后正常恢复10 min组、氧糖剥夺诱导120 min 后正常恢复30 min 组和氧糖剥夺诱导120 min 后正常恢复60 min 组。采用Annexin VFITC/PI 流式细胞术对样品进行检测，区分实验样本中正常、坏死、凋亡细胞。
1.2.4 Western 印迹技术检测上述步骤中各种细胞的SGK1 表达实验对样本进行总蛋白提取与定量，根据SGK1 的mRNA序列(序列号: NM_001193568.1)设计了该基因的全基因引物，获得目的基因SGK1 模板，构建质粒载体，并进行过表达效率检测。
1.3 统计学方法采用SPSS16.0 进行分析。结果
2.1 氧糖剥夺诱导海马神经元凋亡及SGK1 表达情况NC 代表未经任何处理的培养过的SD 大鼠海马神经元细胞、OGD 表示对培养过的SD 大鼠海马神经元细胞进行了120 min 的氧糖剥夺，而10 min 组、30 min 组和60 min 组则表示培养过的SD 大鼠海马神经元细胞在进行了120 min 的氧糖剥夺之后分别进行了10 min、30 min 和60 min 的氧糖正常供给。
2.2 SGK1 基因蛋白水平的过表达能阻止氧糖剥夺120 min 的培养过的SD 大鼠海马神经元细胞的凋亡与NC 组比较，转染SGK1 过表达载体的细胞内，可以SGK1 导致mRNA 的表达增加约5 倍;在转染了SGK1 过表达病毒载体的细胞中，SGK1 基因在蛋白水平的表达约超过未处理组的2.5倍。海马神经元分别转染了空载体或编码SGK1 基因的表达载体;在转染24 h 后，SGK1 在基因水平和蛋白质水平的变化情况和NC 相比具有显著性差异。海马神经元分别转染了空载体或编码SGK1 基因的表达载体24 h，然后进行120 min 的氧糖剥夺，然后使之恢复60 min;运用流式细胞仪分析用膜联蛋白V/PI 双染色法来检测细胞凋亡情况。通过免疫印迹实验检测SGK1 和活化的金属基质蛋白酶(caspase)-3 蛋白水平差异情况。讨论
缺血性脑血管病是目前导致人类，尤其是老年人致死和致残率最高的疾病之一。对于缺血性脑血管病当前最主要的治疗原则是对缺血区域进行血液灌注;然而近期发现对缺血性脑血管疾病的缺血再灌注非但没有使组织功能恢复，反而会导致缺血所致的功能障碍和结构破坏进一步加重，这种现象即缺血再灌注损伤，在各种模式生物和人类研究中都得到了一致的结果。
本研究结果发现，对体外培养的SD 大鼠海马神经元细胞进行氧糖剥夺可导致SD 海马神经元细胞凋亡数量的增加，而之后随着再恢复氧糖供应时间的增加，神经元细胞凋亡的数据则呈现进一步加剧的趋势。而SGK1 的过表达则可以抑制SD大鼠海马神经元细胞因氧糖剥夺导致的细胞凋亡的趋势。另外本结果显示，SGK1 的过表达能显著降低因氧糖剥夺导致的SD 大鼠海马神经元细胞凋亡的数量，这一结果得到了荧光辅助细胞筛选分析的支持，提示Akt 和GSK-β 可对经受缺血再灌注海马神经元细胞能起到保护作用。
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