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核农学——核辐射诱变育种技术及其应用
学院：农学院
专业班级：种子科学与工程111班
姓名：何坤辉
学号：2011010203
摘要：核辐射诱变育种技术是多样的，在农业中的应用也是多方面的。所以，在这里我只列出一项核辐射诱变育种技术：“定向诱导基因组局部突变技术”进行分析说明。定向诱导基因组局部突变技术是一种全新的、高通量和低成本反向遗传学研究方法。近年来，随着突变筛选技术的革新，该技术平台日趋多元化，使得该技术的操作更为简单、快速，并广泛应用于作物育种研究领域。本文章主要对该技术平台的最新发展动态进行简要介绍，对辐射诱变处理与该技术高通量筛选相结合在诱变育种中的应用前景加以分析。
关键词: 定向诱导基因组局部突变技术;高分辨率溶解曲线;辐射诱变育种
引言：随着多种模式生物基因组DNA 测序的完成,基因组学进入了以研究基因功能为目标的后基因组时代，而功能基因组学已经成为植物科学研究的主流。反向遗传学是功能基因组学的重要组成部分。反义RNA 技术、RNAi 和DNA 插入突变是反向遗传学常用技术。但这些技术都存在不可预知性和危险性等不利因素，同时，因为这些技术均需耗时的转基因和组织培养，从而使这些技术在反向遗传学的应用中受到极大限制。定向诱导基因组局部突变技术是由美国Fred Hutchinson 癌症研究中心StevenHenikof 领导的研究小组发展起来的，一种全新的、高通量和低成本的反向遗传学研究方法。自2000 在模式生物拟南芥中应用以来，已经成功地应用于多种生物中。随着研究的深入，该技术平台也在多样化。本文归纳了近年来该技术平台的发展以及最新动态的资料，并对其发展前景进行估测。
定向诱导基因组局部突变技术的基本路线
当前最为成熟和应用最为广泛的该技术平台是基于酶切以及双色红外荧光检测系统的技术平台，下面以此平台为例对该技术的原理和基本路线进行介绍：
①用适当浓度的化学诱变剂甲基磺酸乙酯处理种子，产生一系列的点突变位点；
②种植诱变后的种子培养M1代植株，M1植株自交产生M2代种子;③培养M2 代植株并提取其总DNA, 存放于96 孔板，形成DNA 库，并收取种子形成种子库;
④将若干个96 孔板DNA 合并到一个96 孔板，形成DNA 池； ⑤根据感兴趣的基因序列信息，设计带有红外荧光标记的特异引物进行多聚酶链式反应扩增;
⑥PCR 产物经多次变性、复性，在含有突变位点处形成异源杂合双链;⑦酶切，用特异性核酸内切酶酶切异源双链； ⑧酶切产物电泳分析；
⑨利用相同方法从突变池中筛选突变个体； ⑩突变个体PCR 片段测序;⑪调出位点变异对应的突变单株的种子，种植M3代，从表型上验证变异，最终揭示该基因的生物学功能。定向诱导基因组局部突变技术平台的发展
随着各种筛选技术的不断革新，该技术平台日趋多元化，各种技术平台的区别主要体现在异源杂合双链的检测手段方面。虽然，目前以基于酶切和双色红外检测系统的技术最为成熟和应用最为广泛，但是由于CEL I 酶的分离步骤繁多和耗时长，商品价格昂贵，使得大规模应用的成本难以承受。于是，近年来越来越多的筛选技术逐渐引入该技术平台中，如焦磷酸测序技术、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术、构象敏感毛细凝胶电泳技术，以及高分辨率溶解曲线技术。
常用的几种筛选突变的方法都需要经过PCR这一过程。HRM技术在PCR扩增后即可直接用来分析样品，不需要样品的分离纯化，因而可以降低分离纯化过程中所带来的样品污染的可能性，同时也能大大减少工作量。而在众多的新型检测手段中，以HRM 技术发展潜力最大。
HRM原理及特点
HRM 技术是2002 年由美国犹他大学和爱德华科技公司合作开发而成，是应用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。其基本原理是：利用饱和荧光染料LC Green标记DNA 双链，由于突变位点碱基的不匹配会导致双链DNA在升温过程中会先解开，荧光染料会从局部解链的DNA分子上释放，因而从荧光强度与DNA溶解曲线就可以判断突变位点是否存在。
HRM 技术不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品基因型的分析。该技术的优点主要有:
①快速、高通量；
②准确性好、灵敏度高、特异性好； ③重复性接近100%；
④费用低；
⑤染料探针在PCR 前加入，不需要后续的分离纯化，而且染料的加入不影响后续的测序工作，实现了真正的闭管操作；
⑥只需将PCR 产物放入仪器内检测即可。
个体化定向诱导基因组局部突变技术
2010 年Bush和Krysan在HRM技术平台的基础上对传统定向诱导基因组局部突变技术进行了改进，建立起了一个名为个体化定向诱导基因组局部突变技术的技术以减少突变筛选的成本。个体化定向诱导基因组局部突变技术与传统的定向诱导基因组局部突变技术相比，其最突出的特点主要体现在以下两个方面：
①M1代种子自交后得到M2代种子，M2代种子可以整体收获，而不是像传统的定向诱导基因组局部突变技术需要分株收获M2代种子。
②M2代种子播种在含有琼脂的96 孔板上,根逐渐生长，部分根组织穿过琼脂进入水相中，下层板经干冰乙醇浴后冻结成冰，移开下层板便可分别得到根组织和幼苗。再结合HRM 技术定向诱导基因组局部突变进行筛选，筛选到的突变植株可以从上层96孔板中移栽至土壤中，进行下一步分析，从而大大缩短了筛选周期。定向诱导基因组局部突变技术在辐射诱变育种中的应用展望 ㈠定向诱导基因组局部突变技术应用于辐射诱变育种的技术路线
参考EMS定向诱导基因组局部突变技术流程、γ射线诱变的定向诱导基因组局部突变技术流程以及定向诱导基因组局部突变技术平台的最新发展趋势，有人提出如下技术路线:
①辐射诱变获得M1 种子；
②按单株播种M1种子M1植株自交获得M2种子;
③培养M2代植株并提取其总DNA,存放于96 孔板，形成DNA 库，并收取种子形成种子库;④将若干个96 孔板DNA 合并到一个96 孔板，形成DNA 池;⑤根据感兴趣的基因序列信息，设计引物，在PCR 反应前加入LC Green 饱和荧光染料,然后将PCR 产物直接放入LightScanner 中进行溶解，在一定的温度范围内将PCR 扩增产物进行变性，使DNA 双链逐渐解链，应用相应软件进行突变分析就可以获得突变池;
⑥利用相同方法从突变池中筛选突变个体;⑦突变个体PCR 片段测序，通过全片段测序，确认核酸多态的类型、位置和数量;⑧调出位点变异对应的突变单株的种子，种植M3代，从表型上验证变异。㈡应用意义及前景
辐射育种以其简便、安全以及突变率高、变异谱扩大、能打破旧的性状连锁、实现基因重组且变异性状稳定、短时间内可育出新品种等特点而成为作物品种改良的重要途径之一。
在众多的辐射诱变源中，重离子束具有能量和质量沉积效应，同时还具有传能线密度大、相对生物效应高和损伤后修复效应小等其他常规辐射源所没有的优势，在植物诱变育种研究中具有突变率高、突变谱广和突变体稳定周期短等特点。近年来，重离子束辐照诱变育种工作在国内外蓬勃发展，取得了丰富的成果。2009 年，Niw a 等首次利用12C6+ 离子束辐照野生型条斑紫菜，成功筛选到色素变异细胞。中国科学院近代物理研究所与甘肃省张掖市农业科学研究所合作, 利用兰州重离子研究装置提供的重离子束选育出矮秆、抗逆、高产、优质的春小麦M-920 和丰产、高蛋白含量、抗黑穗病的陇辐2 号，并取得了巨大经济效益。定向诱导基因组局部突变技术实质上是一种高通量点突变筛选方法和快速精确鉴定技术，该技术借助高通量的检测手段，能够快速有效地从诱变过的突变群体中鉴定出突变体。如果将该技术与辐射诱变技术, 尤其是与重离子束诱变结合起来，不但可发挥重离子束辐射诱变频率高和优异变异多等优点，还可以融合定向诱导基因组局部突变技术的高效筛选性和结果可预见性等优点，能有效剔除非遗传变异，显著提高选择效率，从而加快植物辐射诱变育种的进程，为今后开展植物重离子诱变高通量筛选工作奠定基础。参考文献：
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