DNA病原—圆环病毒2型PCR检测方法专题_dnapcr检测方法

DNA病原—圆环病毒2型PCR检测方法专题由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“dnapcr检测方法”。

猪圆环病毒2型PCR检测方法操作程序

廖荣斌，何启盖

（华中农业大学动物医学院）

一、原理

猪圆环病毒2型感染引发的仔猪断奶衰竭综合症、肾炎与皮炎、增生性肠炎以及母猪繁殖障碍。通过病原检测和病毒分离是确证本病的重要手段。猪圆环病毒分为2种，即圆环病毒1型和圆环病毒2型。前者不致病，后者可致病。猪圆环病毒2型（PCV2）的基因组大小为1768 bp或1767bp。其中，PCV2 ORF2基

因与免疫保护和毒力等重要特性有关，同时，此基因与PCV1的同源性较低，通

过合理设计引物，扩增ORF2，从而可检测并区分PCV2与PCV1。

PCR技术具有快速、敏感的优点，已经用于许多动物疾病病原的检测。本试验是利用我们设计的引物，通过反应条件的优化，以感染猪组织或血液为模板，扩增PCV2的ORF2基因，从而作出感染的结论。

二、材料准备

1、手术器械：采样用。根据样品数量来确定。

2、微量移液器（规格：2.5l，10l，100l，200l，1000l）

3、反应引物

上游引物：CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT；

下游引物：CGC ACC TTC GGA TAT ACT GTC4、磁珠：用于吸附和分离DNA4、PCR仪：东胜创新

5、电泳仪：北京六一电子设备

6、紫外检测仪：Bi0-RAD凝胶成像系统

7．相关溶液及配方：

1╳TAE buffer（电泳缓冲液）配方：（1）称量Tris：242g，Na2EDTA.2H2O：

37.2g，置于1L的烧杯中；（2）向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌溶解；

（3）加入57.1ml的醋酸，充分搅拌；（4）加去离子水将溶液定容至1L后，室 1

温保存；（5）使用时将室温保存的该溶液稀释50倍即可使用。

扩增产物的样品缓冲液：全式金生物6╳Loading buffer。

三．样品采集

感染猪或流产的胎儿的肺脏、淋巴结、脾脏和肾脏；发热期猪的抗凝血或血

清；每个样品用单独的剪刀或刀片，避免交叉污染。

样品置冷藏条件下送检。也可放冷冻保存。

四、模板的制备（DNA提取）

*（注：所用DNA提取试剂盒为日本TOYOBO产品）

1、取组织100mg（或血液100ml）以下放入1.5ml离心管中，然后加入850l的溶解吸附液，再使用匀浆器充分匀浆。

2、离心分离（10000rpm，5分钟)后，将上清液吸入新的1.5ml的离心管内。

3、加入40l磁珠，然后使用涡旋振荡器剧烈混合10分钟（注意：加入磁珠前，要把磁珠混匀）。

4、将离心管置于磁性台架上，放置30秒使磁珠聚集，然后去除上清液。

5、离心管中添加900l 洗净液，然后涡旋振荡剧烈混合5秒。

6、将离心管置于磁性台架上，放置30秒使磁珠聚集，然后去除上清液。

7、重复步骤5和6.8、离心管中添加900l 70﹪的乙醇溶液，然后涡旋振荡剧烈混合5秒。

9、将离心管置于磁性台架上，放置30秒使磁珠聚集，然后去除上清液。

10、重复步骤8和9.11、添加100l灭菌水后，剧烈震荡10分钟，使DNA溶出。

12、将试管置于磁性台架上，通过放置30秒使磁珠聚集，然后将含有DNA的上

清液回收至新的1.5ml离心管内，上清液即为DNA模板！

13、阴阳性对照的设立：利用灭菌三蒸水和PCV2阳性病毒液（或者所保存的临

床PCV2阳性病料）与临床送检病料同步提取DNA，分别作为PCV2临床检测的阴性

对照和阳性对照。

五、配置PCV2-PCR的标准反应体系（单重扩增）：

10×扩增缓冲液2.5ul

dNTP混合物2ul引物（10mM）各1ul

模板DNA4ul

Taq DNA聚合酶0.15ul

加灭菌三蒸水14.35ul

即总反应体系25ul.六、扩增

将配好样品的PCR管放入PCR仪中选择适合反应条件的程序进行扩增。退

火温度54°C。

反应条件：按如下程序进行扩增: 94℃变性5 min后,进入循环94℃

30sec,54℃ 40sec, 72℃ 45sec,35个循环后,72℃延伸10 min。

七、配置琼脂糖凝胶块

1、材料：广口瓶、琼脂糖、电泳液

2、制作步骤：

（1）、称取琼脂糖1克放入广口瓶内。

（2）、取电泳液100ml加入广口瓶，即为1﹪的琼脂糖混合液。

（3）、然后放入微波炉中加热2分钟，取出后冷却约56℃。

（4）、倒入容器中，混合液约占容器容积的1/2—2/3。

八、电泳

1、扩增结束后，每只PCR管中都加入约2.5ul的6╳Loading buffer（电泳样品

缓冲液）

2、将制备好的凝胶块放入DNA电泳仪内的电泳液中，胶块有孔的一侧靠近负极。

3、从滴加有电泳样品缓冲液的样品中分别取7ul注入胶块相对应的孔内。

4、注入5ul的分子量（DL Mark 2000）对照。

5、电泳到凝胶块的1/2—2/3处。

九、图片观察

1、电泳结束的凝胶块放入溴乙锭（荧光物质）中浸泡10min。

2、放入成像系统中照胶。

3、结果判定（目的片段大小是494bp）如图1.******8M bp

图1.临床病猪圆环病毒PCR检测的凝胶成像图片

1：阴性对照；2：阳性对照；3—18：湖北某规模化猪场送检病料；其中3—6，8，11—12，15—16为PCV2感染阳性。其余被检病料为PCV2感染阴性，M(分子标记): DL Mark 2000。

4．结果分析

（1）感染的判定：PCR结果为阳性，表明为PCV2感染；阴性表明无PCV2感染。

（2）疾病的判定：由于本病毒感染较广，PCR阳性结果需要与猪群的流行病学以及临床表现（断奶消瘦、咳嗽、体温升高、腹股沟淋巴结肿大）等结合考虑。

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