神经元发育与退行性病变的分子细胞遗传机制_遗传的细胞与分子基础

神经元发育与退行性病变的分子细胞遗传机制由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“遗传的细胞与分子基础”。

自然科学基金申请书

项目名称：

神经元发育与退行性病变的分子细胞遗传机制

申 请 者：

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申请日期：

川北医学院

637000 南充市顺庆区涪江路234号

0817-2340136

2011年12月

一、研究内容

主要研究内容:（1）Rheb/mTor信号通路在神经元发生、极化、网络化及神经退行性病变中的作用及分子机制：

体外研究发现，mTOR信号通路对神经元的发生、发育起重要作用，而Rheb处于mTOR蛋白上游并对其起正调节作用，前期工作发现，Rheb1敲除小鼠的大脑发育出现明显异常。我们的初步研究表明小鼠中mTOR的激活需要与神经元早期发育密切相关的Rheb1。Nestin-Cre介导的神经前体细胞敲除Rheb1导致小鼠大脑体积和重量均减少约50%。基于上述，我们计划深入研究Rheb/mTOR信号通路在神经元发生阶段作用和机制。预计本课题将帮助我们阐明Rheb1/mTOR信号通路在神经元发生作用和机制，为相关疾病的防治提供理论基础。

（2）与铁离子代谢相关基因在神经元发生、极化和网络化中的作用及分子机制：

研究结果表明，铁离子与神经元的发育密切相关，但其分子机理尚不清楚。为深入研究铁离子和铁转运蛋白在脑神经发育中的分子机理，我们将在神经前体细胞中敲除铁离子运输基因包括铁转运蛋白受体（Transferrin Receptor，TFR）、二价金属转运体（DMT1）和运铁素（Ferroportin，Fpn或SLC40A1)。铁转运蛋白受体主要摄取转铁蛋白结合铁（Transferrin-bound iron，Tf-Fe），二价金属转运体主要摄取非转铁蛋白结合铁（Non-Transferrin-bound iron，NTBI），而运铁素在机体内唯一具有从细胞内泵出铁离子的蛋白。这三个基因涵盖了细胞摄取和泵出铁离子的主要通路。通过本课题的研究我们将确定铁离子转运在神经元发生过程中的作用和机理，为防治铁离子代谢失调引起的神经性疾病奠定基础。

并且体外试验已经表明Numb调节神经元的极化。铁离子、转铁蛋白与内吞调节蛋白Numb共同参与内吞功能，但在脊椎动物中还未有遗传学证据证明这些分子介导的内吞调节神经元的极化。本课题将以这些基因敲除小鼠为模型，运用多种前沿生物学技术阐明中枢神经系统神经元摄取、泵出铁离子的通路和内吞调节蛋白Numb/Numblike在神经元极化中的作用及分子机制。课题的研究将确定TFR、DMT1、Fpn、numb和numblike信号通路是否是神经元极化所必需的，同时将为进一步揭示它们调控神经元极化的分子机制，为相关疾病的防治提供新的途径。

（3）研究Gsα在神经元极化中的作用及分子机制：

我们的前期工作表明异三聚体G蛋白的亚基Gs称性分裂和细胞极性，Emx1-cre介导的在大脑的神经前体细胞中敲除Gs致大脑的重量减轻50%和产后月内死亡。虽然我们已在Gs胞不对称细胞分裂的调控方面取得显著进展（被资助），最近体外和遗传学研究提示Gs题的研究将确定Gs号通路调控神经元极化分子机制。

（4）BDNF在神经元网络化中的作用及分子机制：

BDNF几乎在神经元的各个发育阶段都具有重要功能。其基因突变Val66Met导致它在神经元内活性诱导分泌缺陷，因而造成精神疾病，但是具体的分子机制还不清楚。为此我们建立了BDNFmet转基因小鼠模型。此模型真实反映BDNFmet相关精神疾病的行为特点。预计本课题的研究将确定BDNFmet在树突和树突棘形成中作用和分子机制，及对神经传递的调节，进一

Gs 3

步深化理解BDNFmet诱导精神疾病的发生病理及环境因素对BDNFmet精神疾病的影响，发现治疗BDNFmet诱导精神疾病的介入方式。（5）线粒体自噬在神经元发育和退行性病变中的功能及调节机制：

线粒体自噬是细胞控制线粒体数量和清除受损线粒体的唯一途径。线粒体自噬不足会导致受损线粒体的积累，引起细胞凋亡；而线粒体自噬过量会导致ATP水平下降，引起细胞的自噬性死亡。由于神经元对线粒体的正常运行具有特别高的要求，它们必须具备精细的线粒体自噬调节机制，以将它控制在适当水平。在本课题中，我们将运用细胞筛选方法分离线粒体自噬的促进因子和抑制因子，通过研究它们的生化功能，揭示线粒体自噬特有的调节方式。进一步通过研究它们在神经元发育和退行性病变过程中的作用和变化，阐明线粒体自噬在神经系统中的功能和调节机制，为发展相关神经疾病的新一代防治方法提供理论基础。

二、预期目标

总体目标：

确定在神经细胞发生发育及退变过程中起重要作用的信号分子，阐明在该过程中胞外信号如何通过细胞内信号传导发生作用，为防治神经精神性疾病提供理论依据，并为相关疾病研究建立动物模型。

五年预期目标：

1、对神经细胞发生，极化，突触形成，及神经退行性病变的机理研究有所突破，明确Rheb/mTOR通路在神经元发育及退行性病变中的作用和机理，确定是 4

否可通过干预mTOR通路治疗神经精神疾病。

2、利用制备的条件性基因敲除小鼠建立一系列特异小鼠模型，确定信号蛋白的不对称分布和膜蛋白内吞在神经元发育和退行性病变中作用及机理。

3、明确变性蛋白、老化线粒体的清除与退行性病变的关系，建立以干预线粒体自噬活力为基础的神经精神疾病治疗方法。

4、建立和完善小鼠遗传学，活体影象等公用技术平台。

三、研究方案

总体研究方案

项目拟以神经元为研究核心，分别围绕神经元的发生与极化，神经突起的形态发生，以及神经元退行性病变的分子机制等问题，从分子、细胞乃至整个机体的层次进行系统而深入的研究。我们希望通过构建一系列神经细胞特异性基因敲除小鼠，结合多种现代生物学前沿技术，如高分辨荧光染色影像分析、基因工程报告小鼠、免疫共沉淀、RNA干扰等，阐明上述问题的分子机制，为进一步的研究和临床治疗打下坚实基础。本课题立意新颖，技术先进，重点突出，内容具体，具有极大的理论研究意义和实际应用价值。

本项目的特色与创新性：

1． 立题新颖：我们的研究将首次揭示胞内调控因子，如

Gsα、Rheb和Fe，在神经元分化发育过程中的作用和机制。本项目的研究内容处于当代生命科学的前沿，国内外均未见类似的研究报道。

2． 技术先进：我们将大量采用目前世界上先进的生物学研究手段，如条件性基因敲除和报告基因技术（如Rosa26-GFP），荧光标记和成像（如catFISH）等，着重在体内研究基因在神经元发生和发育中的作用。

3． 取得重大突破的可能性大：参与本项目的科学家积累了大量前期工作的基础，在Cell，Nature，Science，Nature Genetics，Nature Neuroscience，Neuron，Moleculler Cell，Development，Genes Development等世界顶级杂志上发表论文26篇，影响因子达520，被引用次数达6000多次。该项目应用先进的技术手段，在大量前期工作基础上，研究神经元的发生、极化、树突形成及退变的分子机制等神经发育生物学的重大问题。项目所需关键条件性基因敲除小鼠和Cre小鼠已制备（如下图），因此，取得重大突破的可能性极大。

4． 神经系统发生发育的基础研究与临床疾病紧密相关。神经元生理功能和调节的失调将导致神经元退行性病变，如老年性痴呆症和帕金森氏病，我们对相关机制的阐明将有利于寻找新的药物靶点，开发新的神经元保护药物，从而为治疗神经疑难疾病发现新途径。

课题设置: 1)神经元发生的分子机制：重点研究Rheb/mTOR信号通路和铁离子在神经元发生中的作用和机制；2)神经元极化的分子机制：重点研究G-蛋白信号通路（Gsa,Rheb）和铁离子在神经元极化中的作用和机制；3)神经元突起形态发生的分子机制：着重研究生长因子BDNF、Rheb和铁离子在神经元突起形态发生的作用和机制；4)神经元退行性病变的分子机制：侧重研究线粒体自噬和Rheb/mTOR信号在神经元退行性病变中的作用和机制。

各课题既重点突出、内容具体、责任明确, 又互相合作、相互促进。各课题之间将在资源、技术和人才三方面充分实现共享，我们将共同利用多品系的基因敲除小鼠进行各课题相关基因功能的研究，节约大量的人力和经费，并且互相学习先进实验技术和交换专业人才，提高科研效率。

研究内容

1.建立和验证多个神经细胞特异性mTOR上游分子Rheb1、Rheb2及下游分子Shank3敲除小鼠品系。

2.初步分析Rheb/mTOR信号对大脑皮层、海马神经元和小脑蒲肯野细胞发生、极化和网络化的影响。

3.探讨Rheb/mTOR信号异常与神经祖细胞损伤的关系。

4.建立和验证TFR和Fpn等铁离子代谢相关基因的中枢神经系统敲除模型。5.初步分析上述基因敲除小鼠是否出现中枢神经系能发育异常。

6.探讨Gsα与神经细胞极化分子如Par3，Par6，LKB1或numb等的转运和定位的关系。7.通过转基因小鼠观察BDNFmet变异导致的神经元树突发生异常有无脑区的特异性，是否有不同脑区间的神经环路改变及其相应的行为学异常。

8研究BDNF及其受体TrkB参与活性调控神经突起形态发生的分子细胞学机制。9.完成线粒体自噬调节因子的筛选，并在体外培养的细胞中验证所筛选出的果蝇基因及其哺乳类同源基因具有线粒体自噬的调节功能。

10.研究AD、PD相关突变是否通过改变线粒体通透性骤变孔（mPTP）的开关来引发或抑制它们的自噬，并进一步探讨它们影响mPTP的生化机制。

11.着重在生化机理方面有所突破，如，探讨Rheb/mTOR信号是否影响与神经细胞极化、神经突起的形成、网络化相关的基因转录与蛋白质合成；初步揭示Rheb/mTOR对自噬在神经元发育与退行性病变中的功能调控的分子机制，切实做到表型/功能分析与机理有机结合。

预期目标

1.完成TFR和Fpn等铁离子代谢相关基因的中枢神经系统敲除模型的制备及验证，包括TFRf/f-Nestin-cre和Fpnf/f-Nestin-cre，为研究铁离子代谢在神经元发生、极化、网络化和死亡/退变中的作用打下基础。

2.建立和完善与研究神经系统发育相关的解剖学，免疫组化及体内成像等实验技术，检测上述基因敲除小鼠是否出现中枢神经系能发育异常。

3.完成多个神经细胞特异性Gsα敲除小鼠品系的制备及验证，包括Gsαf/f-Nex-cre, Gsαf/f-Nestin-cre和 Gsαf/f-Nestin-creER，为研究Gsα在神经元极化中有作用和分子机制打下基础。

4.建立并完善膜片钳技术测定轴突和树突专一的钾钠通道，并利用此技术初步研究Gsα在神经元极化中的作用。

5.多个BDNF转基因小鼠系的制备和验证，包括BDNFmetThy1-EGFP，BDNFwtThy-EGFP，为研究BDNF在神经突起形态发生中的作用和分子机制打下基础。6.确定BDNF及其受体TrkB在神经元活性调控突起生长中的作用，以及BDNFmet突变是否干扰了此过程及其机制。

7.建立线粒体自噬速度的萤光测定方法，并确定能明显提高或降低线粒体自噬速度的AD、PD相关突变。

8.建立线粒体自噬调节因子的细胞筛选系统，包括果蝇的Tom20-Dendra2稳定细胞株和RNAi库，并通过早期测试，确定大通量筛选的可行性。

9.确定线粒体自噬在神经元发育过程中的作用和调节机制。10.确定线粒体自噬异常导致神经元退行性死亡的分子机制。

11.确定AD、PD相关突变是否通过影响新筛选出的调节因子来改变细胞内的线粒体自噬水平，并进一步阐明它们的作用机制。