副猪嗜血杆菌的现状与研究进展_副猪嗜血杆菌研究进展
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副猪嗜血杆菌的现状与研究进展
副猪嗜血杆菌(haemphilus parasuis, HPS)HPS为革兰氏阴性、具多种不同形态的细菌,从单个球杆状到长的、细长的以至丝状菌体,常可见荚膜。该菌生长依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD或V因子),不需要X因子(血红素和其它卟啉类物质)(Mollen等,1990)。其在巧克力培养基上培养24~48 h生长较差,为光滑型、灰白色透明、直径大约0.5 mm菌落。如与金黄色葡萄球菌共同培养时,HPS在葡萄球菌条状菌苔附近呈卫星生长,生长良好,菌落直径可达1~2 mm。HPS在血液琼脂上呈小而透明的不溶血菌落,在加NAD、马血清的M96支原体培养基或加NAD、马血清和酵母浸出物的PPLO培养基上生长良好。生化反应:尿酶试验阴性、氧化酶阴性、接触酶试验阳性,可发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖和麦芽糖等。
一、现状
HPS引起病称也称猪革拉泽氏病,近年来，随着养猪业的不断发展，猪场规模化、集约化程度的不断提高，猪群高密度饲养越来越多，呼吸道疾病逐渐成为继繁殖障碍性传染病、胃肠道传染病之后危害养猪业的三大症候群之一。特别是近些年来，猪“高热性”呼吸道疾病的全面蔓延和迁延不愈，尤其是以副猪嗜血杆菌引起的以猪多发性浆膜炎、关节炎、呼吸困难、高热及高死亡率为特征的传染性疾病给养猪业带来巨大的经济损失。
在我国，2001年5月开始在华东地区大面积流行，造成了严重的经济损失，个别猪场由于本病的发生不能及时控制，出现严重亏损，甚至倒闭。在这次流行过程中，新发病猪群的发病率几乎达到100%，哺乳仔猪死亡率高达100%，保育猪死亡率高达80%以上，育肥猪死亡率不高，但猪群整体健康水平较差。发病较久的猪群，哺乳期间发病率较低，40日龄之前发病率较低，45日龄后的保育猪几乎100%发病，而且死亡率高达85%以上。当时在广东省，据我们对省内部分地区猪场的调查，革拉瑟氏病的危害也比较严重，占断乳猪死亡率的30%以上，严重猪群高达80%～100%。近几年，对广东省的四会市、顺德、开平、新会、江门、佛山、云浮、韶关、乐昌、龙川、广州萝岗、汕尾，江西省的南昌市、东乡、樟树、定南、潘阳地区，湖南省的衡阳，福建南平，上海等地猪场，进行病原菌的分离鉴定与疾病调查。被调查猪场普遍存在副猪嗜血杆菌感染，而且相当严重，剖检保育阶段的病死猪，90%以上都有典型的副猪嗜血杆菌感染所引起的病变。本病是断乳后保育猪死亡的主要原因。在近几年出现的所谓“高热病”发生猪群，均存在着副猪嗜血杆菌的混合感染。
本病的临床症状出现的往往很突然，先在一头猪或几头猪发病，几天后，才大批出现症状。病程分为过急性型或急性型，常常是体重最重的仔猪受感染。临床症状取决于病变发生的部位。发病初期体温增高至40.5℃～42℃，沉郁，食欲不振，最终食欲废绝。外周循环障碍，皮肤发绀。有时见到眼睑和耳部皮下水肿，结膜潮红。呼吸也可能正常，也可能出现呼吸困难。有的病猪表现出痛苦的叫声，由于跛行而行走缓慢或呈犬坐式。一个或几个关节肿大，腕关节和跗关节多发。有很多病例表现出脑膜脑炎症状，肌肉振颤，行动迟缓，后肢供济失调。有的病猪向一侧倾斜，勉强能站立。国外有报道认为，1～2周龄仔猪感染，易出现败血症。
二、研究进展
2．1流行病学
副猪嗜血杆菌感染呈地方性流行。主要通过直接接触传播。多是因从感染性猪群引进带菌猪而带进致病性菌株。各年龄猪均易感染，都可爆发本病。同样，一旦抗原性不同的新的强毒菌株侵入猪群，也可以引起疫病爆发（Oliveira和Pijoan，2002）。在感染性猪群中，母猪是病菌的储主，无论是致病性还是非致病性菌株，仔猪都是在哺乳期被感染的。但是事实上，母猪的带菌率并不高，因此被感染的仔猪也只是一小部分。被感染的小猪可因感染而产生免疫力，但以后也可能成为亚临床带菌猪。未被致病性菌株感染的仔猪，可从母源抗体获得保护。到5~6周龄断奶时，母源抗体水平下降，可因断奶因素的影响而致使亚临床带菌
猪数量增加，那些在哺乳期没有接触过致病性菌株的猪只开始发病。因此，本病的临床症状通常在5~6周龄时即断奶之后出现。
2．2副猪嗜血杆菌的血清型研究进展
副猪嗜血杆菌的血清型复杂多样，按琼脂扩散血清分型方法Kieletein-Rapp-Gabiedson(KRG)，可将副猪嗜血杆菌分为15 个血清型（国际公认的血清分型标准菌株）。在全世界范围内，各国流行的血清型不尽相同，我国分离株主要是血清4、5、12、13型，在日本和澳大利亚广泛流行的血清型为5型，而危害美国猪场的HPS血清型为4型。在鉴定的15个血清型中毒力存在明显的差别，血清型1、5、10、12、13、14型毒力最强，患猪在4内归于死亡或处于濒死状态；血清2、4、15型为中等毒力，患猪通常不死亡但出现多发性浆膜炎；血清3、6、7、8、9、11型感染猪后没有明显的临床症状，这些菌株归类为无毒力菌株。另有20%以上的分离株血清型不可定。这可能是由于一些分离株不能表达足够多的特异性，或者可能还存在另外的一些血清型。
2．3分子生物学研究
以特异性的PCR方法为基础，建立了限制性内切酶多态性(RFLP)分型方法，先克隆了长为1.9kb的tbpA基因，用TaqI、AvaI和RsaI进行酶切分析，对已知5种血清型的副猪嗜血杆菌菌株进行分析，结果表明RFLP敏感性及分型能力均比琼脂扩散方法强，RFLP方法为100%，而琼脂扩散方法仅为65%。此外，学者们还克隆了副猪嗜血杆菌16srRNA基因、外膜蛋白及脂多糖基因，但具体功能尚不清楚。
2．4发病机理
HPS在呼吸道内早期定居部位现在仍有争议，猪鼻内接种病原菌，病原菌通常在鼻腔和气管分离到，极少从肺和血液中分离到，从未在扁桃体中分离出来。副猪嗜血杆菌在感染期间侵入全身所涉及的因素在很大程度上尚不清楚。Vahle(1997)等研究表明，从鼻腔中部分离到的病原菌与急性关节炎有关，也与鼻－气管黏膜的纤毛缺失及细胞急性肿胀有关。根据试验结果，他们假设这些薄膜特性的改变使得HPS侵入血，黏膜损伤可能会增加细菌入侵的机会，但通过免疫组化及电镜检查等手段都不能在纤毛缺失及细胞降解处检测到HPS，所以认为所观察到的细胞损伤可能由HPS的可溶性毒素所致。其他一些呼吸道性疾病如支原体肺炎、猪流感、猪伪狂犬病和圆环病毒Ⅱ型感染及感染猪呼吸道冠状病毒能降低猪肺泡巨噬细胞的吞噬和杀菌能力,HPS的存在可加剧病情的临床表现。以明尼苏达大学CarlosPijoan博士为首的学者们认为,当前副猪嗜血杆菌病的发生在一定程度上是因为HPS在幼猪体内的定居模式所致。他们认为：只有部分仔猪被母猪排出的细菌所定居,但随着断奶日龄增大，仔猪感染细菌的比率就增加，而提早断奶则可以降低感染的机会。当仔猪体内抗副猪嗜血杆菌的母源抗体水平降低时，不再受母源抗体保护的敏感猪易与致病菌携带猪相接触而发生疾病。临床实践表明，保育舍内暴发猪繁殖和呼吸综合征时，HPS的存在可加剧病情的临床表现，副猪嗜血杆菌会导致死亡率的升高，但其作用机制尚未完全弄清。HPS的感染导致肺泡巨噬细胞损伤，也可引起鼻腔黏膜炎症，导致非特异性呼吸道防卫机制缺陷，使猪发生继发性感染。
2．5副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的研究
副猪嗜血杆菌病灭活疫苗基础菌种的研究 按照《中国兽用生物制品质量标准》要求建立用于副猪嗜血杆菌病灭活疫苗制备与检验用菌株的基础种子，对基础菌种的形态、培养特性、生化特征、血清型、毒力、免疫原性、毒力稳定性和免疫原性稳定性等进行研究。结果表明基础菌种在方面均符合副猪嗜血杆菌的特征，MD0322株为血清4型，SH0165株为血清5型，基础菌种纯粹检验无杂菌生长，两株菌种连代25代以后的毒力和免疫原性均保持稳定不变，在各方面完全符合基础菌种的要求。
副猪嗜血杆菌病灭活疫苗安全性试验 在实验室试制五批副猪嗜血杆菌病灭活疫苗，批
号依次为0301、0302、0303、0304、0305。通过对最小使用日龄靶动物接种、对靶动物各种接种途径一次单剂量接种，对靶动物单剂量重复接种，对靶动物一次超剂量接种以及对怀孕动物(妊娠母猪)接种后观察其精神状态，体温和食欲等指标对疫苗的安全性进行了评价，结果表明该疫苗用于猪的免疫是安全的，无副作用。
四种副猪嗜血杆菌病灭活疫苗对仔猪免疫效力的比较 用副猪嗜血杆菌MD0322株和0165株两株菌种分别制备副猪嗜血杆菌病单价灭活疫苗。将两种单价灭活疫苗与本室试制的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(双价)，以及国外生产的两种副猪嗜血杆菌病灭活疫苗相比较，每种灭活疫苗分别免疫28～35日龄仔猪10头，21日后二免，同时设立10头未免疫对照。二免后14日，分别用血清4型和5型标准菌株经腹腔内攻毒，结果两种单价疫苗的保护率均为4／5，本室试制的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗总的保护率为9／10，两种进口疫苗的总保护率分别为8／10(疫苗含血清4型和5型菌)和5／10(疫苗含血清2型和6型菌)。
副猪嗜血杆菌病灭活疫苗效力试验 通过动物试验对试制的五批副猪嗜血杆菌病灭活疫苗进行效力检验。每批选择28～35日龄断奶仔猪20头，每批疫苗免疫10头猪，另外10头作为对照。在二免后14日分别用MD0322株和SH0165株通过腹腔内攻毒，结果免疫猪保护率均在4/5以上，对照组发病率均在3/5以上，表明试制的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗具有良好的免疫效果。
2.6综合防治的新进展
饲养管理：加强和改善饲养管理可降低副猪嗜血杆菌的发病率。彻底清理猪舍卫生，用消毒药喷雾消毒，每天1次，连续喷雾消毒5 d；用具用2％氢氧化钠溶液洗刷，然后再用清水冲洗。对全群猪用多维饮水6 d，以增强机体抵抗力，减少应激反应。同时给予病猪青菜、萝卜、野菜等青绿多汁饲料，为避免相互传染，将病猪和未表现症状的猪全部分开，隔离饲养。7日龄的仔猪中能检测到副猪嗜血杆菌,早期断奶不能完全控制副猪嗜血杆菌的感染,最关键的措施是减少猪群转运和应激反应,如合理的饲养密度,防止产房和保育室的贼风,加强保温和通风,防止饲料霉菌毒素的感染;隔离引进种猪,种猪入群和小猪合群前用疫苗免疫或用药物净浙江畜牧兽医。2005年第5期化体内细菌性病原体;及时隔离出现临床症状的病猪,进行抗菌素治疗等。
免疫接种：商品苗和自家苗可以防制副猪嗜血杆菌传染病。然而,多种血清型和一定量非分型菌株的存在,影响了有效交叉保护疫苗的发展。Miniats等(1991)用免疫印迹技术分析免疫猪的体液反应与抗原、保护作用之间的关系,结果发现只有针对外膜蛋白(OMP)的抗体与攻毒试验的保护作用有关,完全获得免疫保护的动物无针对脂多糖(LPS)和荚膜多聚糖的抗体。
药物防治：药敏试验显示大多数副猪嗜血杆菌对氟苯尼考、氨苄青霉素、氟喹诺酮类、头孢菌素、氟甲砜霉素及增效磺胺类药物敏感,对四环素、红霉素、氨基糖甙类和林可霉素有抵抗力
三、结束语
目前，副猪嗜血杆菌病在我国猪群普遍存在，已经是引起猪场保育猪死亡的主要细菌性疾病，控制本病的方法是用疫苗免疫接种和药物保健预防，随着副猪嗜血杆菌的诊断，流行病学等方面已取得了重大成就，研究者可以快速，准确的掌握特定猪场中病原的流行病学等相关信息，今后，在确定毒力因子、阐述其致病机理以及获得保护性免疫的机制、以及研制广谱的疫苗等方面都还需要研究工作者进行深入研究。
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