氨基酸的离子交换色谱分离上课讲稿

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同学们好！下面开始上课。

今天我们的实验内容是“氨基酸的离子交换色谱分离”。大家翻到书本第69页。我们的实验目的有三个：

1）了解层析法的概念、特点和分类； 2）复习氨基酸的理化性质；

3）掌握离子交换层析分离生物大分子的原理和方法。

今天实验题目是氨基酸的离子交换色谱分离。所以首先向同学们介绍离子交换色谱。顾名思义，离子交换色谱，就是分离过程是基于离子交换的原理而进行的。具体来说，就是基于带相反电荷的分子的相互吸引。也就是异种电荷相互吸引、同种电荷相互排斥。所以，按照带电荷的正负，离子交换层析一般分为两种类型，一种是阳离子交换色谱，填料上结合有带负电荷的基团，可以与溶液中带正电荷的样品结合；另一种是阴离子交换色谱，填料上结合带正电荷的基团，可以与溶液中带负电荷的样品结合。那么，我们今天使用的是阳离子交换柱，就是你们桌子上的黄色填料。

离子交换色谱是利用样品的带电性质进行的分离。那么，氨基酸的带电性是怎么样的呢？这是基于氨基酸的组成。氨基酸是一种兼性离子。什么是兼性离子呢？就是在溶液中既可以带正电荷，又可以带负电荷。氨基酸包含一个氨基，可以作为氢离子的受体，这是氨基酸成为阳离子；氨基酸又带有一个羧基，可以作为氢离子的供体，这时氨基酸成为阴离子。有这个性质，引申出一个等电点的概念，也就是氨基酸所带净电荷为0的状态。在PH小于等电点时，氨基酸带负电荷，当PH大于等电点时，氨基酸带正电荷。

如何利用离子交换色谱分离两种不同的氨基酸？

因为离子交换色谱根据“同种电荷相斥，异种电荷相吸”原理分离样品，而不同的氨基酸具有不同的等电点，它们在溶液中可能携带相反电荷。所以，我们将溶液调到一特定pH值，让一种氨基酸携带正电荷，使之与离子柱结合；同时，让另一种氨基酸携带负电荷，使之保留在溶液中。

在我们的实验中，我们需要分离天冬氨酸与赖氨酸，天冬氨酸的等电点时2.97，赖氨酸的等电点时9.74。我们可以看到，存在三种情况：

1）pH

2）2.97 9.74，Asp与Lys均带负电荷 是不是只有第二种情况符合我们之前说的方案？

因此，我们的实验基本步骤是：上样，样品液：0.005 mol/L 的Asp与Lys溶于0.02 mol/L HCl中形成的混合液（pH

1）平衡，向层析柱加入pH 5.3的柠檬酸缓冲液，直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止，用pH试纸检查。

2）上样。降低液面至填料表面上方1 厘米左右，加入0.5毫升氨基酸混合液样品。

3）向层析柱加入pH 5.3的柠檬酸缓冲液进行洗脱。

4）用短试管收集天冬氨酸。每管5毫升，收集1-5管。

5）向层析柱加入pH 12的NaOH缓冲液进行洗脱。每管5毫升，用短试管收集6-12管。

6）测定。取0.5毫升收集液于长试管中，加入1毫升pH5.3柠檬酸缓冲液，0.5毫升茚三酮，混合后在100℃加热25分钟，然后水冷却5-10分钟，加入3毫升60%乙醇稀释，用分光光度计在570 nm处检测。

7）绘制洗脱曲线。

8）再生色谱柱：用蒸馏水洗至流出液为中性。

注意事项：

1）柱子不能干。始终保持柱面上方有液体。

2）液体流速与柱面上方液面高度有关，液面越高，流速越快。可以适当增高液面，加大流速，对结果没有影响，可以节省时间。

3）建议大家分工合作。一组进行分离实验，一组进行后面的检测实验。思考题：

1.何为色谱法？其特点是什么？

2.离子交换树脂有几类，各类有何特点？

3.我们这次用的是阳离子交换色谱，假如使用阴离子交换色谱，该如何设计实验？

4.是不是所有的氨基酸都能用离子交换色谱进行分离？