(原创)液相色谱仪入门与故障排查讲稿

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我的分析生涯之液相色谱

各位好！我既然做分析工作，今天就聊聊分析。我是02年毕业就到深圳工作，一直做分析。一转眼就工作4年了。在这期间我用到了很多仪器，在今天，我要聊聊我最喜欢的仪器-----高效液相色谱。

记得第一次接触液相色谱是2004年2月的时候。当时刚从食品分析转行到一家原料药厂，做原料药分析。我是学食品工程的，毕业后就在食品厂作分析。仪器用了不少，但毕竟是转行，也有很多不同的东西要学习。特别是液相对我来说是全新的挑战。不过我当时被毫无变化的食品分析工作折磨得快窒息了，这种挑战正是我所期待已久的。

当时，我是做过气相所以对色谱的基础知识还是有的。那家原料药公司，一共有两台岛津的液相。由于项目多，两台仪器几乎不休息，这样就使我使用他们的频率很高。所以我很快就熟悉了基本操作。不过当时也很累人。经常要一个人同时开两台仪器，而且两台都是手动进样。做过液相的都知道，那可是相当累人的事。更夸张的是仪器比人还累，常常“累坏”。不过这也可谓：塞翁失马，焉知非福？由于用得多出现问题就多，每解决一个问题对自己都是一次提高。我用起来也越来越得心应手。

我是2005年6月份进入清华源兴，开始药品的检测分析。现在用的高效液相是安捷伦的，而且是自动进样。感觉更好了。

其实说起来不同的液相他们的基本操作都差不多也都很简单。

一般第一步是按开关了

先开电脑的，然后是开仪器的。安捷伦的就是从上按到下，先开在线脱气，接下来是泵，然后是自动进样器，下面是柱温箱，最后是检测器。等到电脑检测到各个仪器之后，就可以打开分析软件，这才正式开始通过电脑控制仪器进行操作。

一般经常用的色谱柱保存前都用有机溶剂冲洗过了。所以，换好色普柱后，先用0.5ml/min的乙腈活化一下，大约15-20min，再用15%的乙腈或甲醇以0.8ml/min冲柱子30-40分钟，然后通入配好的样品用流动相。当基线平衡时，就可以进样分析了。分析结束后，再用15%的乙腈或甲醇为流动相，以0.8ml/min冲柱子40分钟以上，使得基线平衡，再用0.5ml/min的乙腈冲柱子15-30min使得基线平衡就可以了。关机就要先关电脑再关仪器。

可见正常使用一点都不难，但是出了问题就比较麻烦。高效液相是个比较金贵的仪器。需要好好维护，它才能老老实实的干活，不然他会罢工的。

说到维护就先说说柱子的维护吧！每天用足够的时间来平衡色谱柱，就会在处理问题方面获得最大的“补偿”，而且你的色谱柱的寿命也会变得更长！

新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。

一般色谱柱使用中要注意几点

1．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围 3．避免流动相组成及极性的剧烈变化 4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理

5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存大乙腈中

6．压力升高是需要更换预柱的信号

在使用仪器中，常常会出现各种突发状况。所以维护很重要。在维护方面，最重要的又常常被忽略的是要观察柱压，因为压力的变化往往是故障的征兆。一般系统稳定后,压力基本会保持不变,如果有异常现象很可能是出了问题。比如：压力持续偏高或偏低；压力波动不稳定；甚至没有压力显示等等。压力持续偏高

原 因 解决方法

1、流速设定过高

1、调整流速设定

2、柱前筛板堵塞

2、a、在允许情况下反冲色谱柱 b、更换筛板 c、更换色谱柱

3、流动相使用不当

3、a、使用恰当的流动相

或缓冲盐的结晶沉淀 b、冲洗色谱柱

4、色谱柱选择不当

4、选择恰当的色谱柱

5、进样阀损坏

5、清洗或更换进样阀

6、柱温过低

6、提高温度

7、控制器失常

7、修理或更换控制器

8、保护柱阻塞

8、清洗或更换保护柱

9、在线过滤器阻塞

9、清洗或更换在线过滤器 压力持续偏低

原 因 解决方法

1、流速设定过低

1、调整流速

2、系统漏液

2、确定漏液位置并维修

3、色谱柱选择不当

3、选择恰当的色谱柱

4、柱温过高

4、降低温度

5、控制器失常

5、维修或更换控制器 压力波动

原 因 解决方法

1、泵中有气体

1、a、溶剂脱气

b、从泵中除去气体

2、单向阀损坏

2、更换单向阀

3、泵密封损坏

3、更换泵密封

4、脱气不充分

4、a、溶剂脱气

b、改变脱气方法（使用在线脱气法等）

5、系统漏液

5、确定漏液位置并维修

6、使用梯度洗脱

6、由于流动相粘度的变化引起的压力波动

没有压力显示，没有流动相流动

原 因 解决方法

1、电源问题

1、接通电源，开机

2、保险丝被烧坏

2、更换保险丝

3、控制器设定不正确或设定失败

3、a、采取恰当的设定 b、修理或更换控制器

4、柱塞杆折断

4、更换柱塞杆

5、泵头内有空气

5、溶剂脱气、启动泵抽出空气

6、流动相不足

6、a、补充流动相 b、更换入口滤头

7、单向阀损坏

7、更换单向阀

8、漏液

8、拧紧或更换手紧接头

B、流动相流动正常，但没有压力显示

原 因 解决方法

1、仪表损坏

1、更换仪表

2、压力传感器损坏

2、更换压力传感器

最常见的故障应该算漏液。通常可以通过拧紧或更换管路接头来解决漏液的问题。但是过份拧紧会导致金属接头的漏液和塑料接头的磨损。如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液的问题，就必须将接头取下，检查是否损坏（例如，卡套损坏、密封表面有杂质）；损坏的接头应该更换掉。不同部位漏液原因也各不相同，解决的关键是找出漏液原因。A、接头处漏液

原 因 解决方法

1、接头松动

1、拧紧

2、接头磨损

2、更换

3、接头过紧

3、a、拧松，再重新拧紧 b、更换

4、接头被污染

4、a、拆下清洗 b、更换

5、部件不匹配

5、使用同一品牌的配件 B、泵漏液

原 因 解决方法

1、单向阀松动

1、a、拧紧单向阀（不必拧的过紧）b、更换单向阀

2、接头松动

2、拧紧接头（不必拧的过紧）

3、混合器密封损坏

3、a、更换混合器密封 b、更换混合器

4、泵密封损坏

4、维修或更换泵密封件

5、压力传感器损坏

5、维修或更换压力传感器

6、脉冲阻尼器损坏 67、比例阀损坏 7 b8、放空阀的损坏 8 bC、进样阀漏液

原 因

1、转子密封损坏

12、定量环阻塞

23、进样口密封松动

34、进样针头尺寸不合适

5、废液管中产生虹吸

56、废液管阻塞 6D、色谱柱漏液

原 因

1、尾端接头松动

12、卡套内有填料

23、筛板厚度不合适 3筛板选择指导

物质粒径 筛板孔径

3-4u 0.5u 5-20u 2u E、检测器漏液

原 因

1、流通池垫片损坏 1换垫片

2、流通池窗破碎

23、手紧接头漏液

34、废液管阻塞

45、流通池阻塞

5、更换脉冲阻尼器、a、检查隔膜，如果漏液立即更换、检查手紧接头，损坏的立即更换、a、拧紧放空阀、更换放空阀

解决方法、重新安装或更换进样阀、更换定量环、调整、使用恰当的进样针、保持废液管高于废液液面、更换或疏通废液管

解决方法、拧紧接头、拆下、清洗卡套、重新安装、使用合适的筛板（参考下表）

解决方法、a、避免过大的背景压力（压力降）b、更、更换窗口、拧紧或更换、更换废液管、重新安装或更换再有看谱图也有很多门道。液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。A、峰拖尾

原 因 解决方法

1、筛板阻塞

1、a、反冲色谱柱 b、更换进口筛板 c、更换色谱柱

2、色谱柱塌陷

2、填充色谱柱

3、干扰峰 a、使用更长的色谱柱

b、改变流动相或更换色谱柱

4、流动相PH选择错误

4、调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰

5、样品与填料表面的溶化点发生反应 a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂 b、更改色谱柱

B、峰前延

原 因 解决方法

1、柱温低

1、升高柱温

2、样品溶剂选择不恰当

2、使用流动相作为样品溶剂

3、样品过载

3、降低样品含量

4、色谱柱损坏

4、见A1、A2:

1、筛板阻塞

1、a、反冲色谱柱 b、更换进口筛板 c、更换色谱柱

2、色谱柱塌陷

2、填充色谱柱

C、峰分叉

原 因 解决方法

1、保护柱或分析柱污染

1、取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞，拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。

2、样品溶剂不溶于流动相

2、改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。

D、峰变形

原 因 解决方法

1、样品过载

1、减少样品载量 E、早出的峰变形

原 因 解决方法

1、样品溶剂选择不恰当

1、a、减少进样体积

b、运用低极性样品溶剂

F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰 原 因 解决方法

1、柱外效应

1、a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路）b、使用小体积的流通池

H、酸性或碱性化合物的峰拖尾

原 因 解决方法

1、缓冲不合适

1、a、使用浓度50-100mM的缓冲液

b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液

I、额外的峰

原 因 解决方法

1、样品中有其他组份

1、正常

2、前一次进样的洗脱峰

2、a、增加运行时间或梯度斜率 b、提高流速

3、空位或鬼峰

3、a、检查流动相是否纯净

b、使用流动相作为样品溶剂 c、减少进样体积

J、保留时间波动

原 因 解决方法

1、温控不当

1、调好柱温

2、流动相组分变化

2、防止变化（蒸发、反应等）

3、色谱柱没有平衡

3、在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱 K、保留时间不断变化 原 因 解决方法

1、流速变化

1、重新设定流速

2、泵中有气泡

2、从泵中除去气泡

3、流动相选择不恰当

3、a、更换合适的流动相 b、选择合适的混合流动相 L、基线漂移 原 因与解决方法

1、柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。）

1、控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器

2、流动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。）

2、使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。

3、流通池被污染或有气体

3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用盐酸）

4、检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）

4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。

5、流动相配比不当或流速变化

5、更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。

6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时

6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。

7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成7、检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂

8、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。

8、使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。

9、使用循环溶剂，但检测器未调整。

9、重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。

10、检测器没有设定在最大吸收波长处。

10、将波长调整至最大吸收波长处

M、基线噪音（规则的）

原 因 解决方法

1、在流动相、检测器或泵中有空气

1、流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。

2、漏液

2、见第三部分。检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。

3、流动相混合不完全

3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂

4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）

4、减少差异或加上热交换器

5、在同一条线上有其他电子设备

5、断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。

6、泵振动

6、在系统中加入脉冲阻尼器 N、基线噪音（不规则的）

原 因 解决方法

1、漏液

1、见第三部分。检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查流通池是否漏液。

2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成2、检查流动相的组成。

3、流动相各溶剂不相溶

3、选择互溶的流动相

4、检测器/记录仪电子元件的问题

4、断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。

5、系统内有气泡

5、用强极性溶液清洗系统

6、检测器内有气泡

6、清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器

7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。）

7、用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池

8、检测器灯能量不足

8、更换灯

9、色谱柱填料流失或阻塞

9、更换色谱柱

10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常

10、维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置

P、分离度降低

原 因 解决方法

1、流动相污染或变质（引起保留时间变化）

1、重新配置流动相

2、保护柱或分析柱阻塞

2、去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞，可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。

Q、所有的峰面积都太小

原 因 解决方法

1、检测器衰减设定过高

1、减少衰减的设定

2、检测器时间常数设定太大

3、进样量太少

34、记录仪连接不当 4

R、所有的峰面积都太大

原 因

1、检测器衰减设定过低

12、进样过多

23、记录仪连接不正确 3、设定较小的时间常数、增大进样量、使用正确的连接 解决方法、采取较大的衰减、减少进样量、正确连接记录仪