植物基因组DNA提取_植物基因组dna提取

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植物基因组DNA提取

一、实验目的1、掌握植物基因组总DNA的抽提方法和基本原理。

2、学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

二、实验原理

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三、实验仪器及试剂

实验仪器：高速离心机；烘箱；冰箱；水浴锅；高压灭菌锅；Nanodrop。

实验试剂：玻璃珠，十二烷基磺酸钠(SDS)；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸（EDTA）；氯化钠；苯酚；氯仿；无水乙醇等。

四、实验步骤

1.SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。

2.将叶片置于1.5ml离心管中，液氮速冻，组织研磨器打样。3.加入700 l的SDS提取缓冲液，涡旋摇匀。

4.置于65℃的水浴中，每隔10 min轻轻摇动，30 min后取出。5.加入200 l KAc溶液，摇匀，放入-20℃冰箱30 min。

6.10000 rpm离心5 min，上清移至新离心管中，12000 rpm离心5 min。7.上清移至新离心管中，加入700 l异丙醇，-20℃冰箱30 min。8.10000 rpm离心5 min，弃上清，加入500 l 70%乙醇漂洗。9.弃液体，晾干。

10.DNA纯度与浓度测定（使用nanodrop）。

（1）DNA纯度：DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。

OD260/OD280  1.8：说明较纯；

OD260/OD280  1.8：说明可能有RNA污染；

OD260/OD280  1.8：说明可能有蛋白质污染。

五、注意事项

1.叶片磨得越细越好。2.注意移液器的正确使用。

3.由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

六、结果与分析

1.植物DNA提取所用试剂的作用？ 2.植物DNA提取的关键步骤有哪些？ 3.植物DNA提取后的用途有哪些？

4.从化学结构、化学性质、存在场所以及功能等方面比较DNA和RNA的异同。