invitrogen trizol rna抽提说明书_qiaamprna提取说明书

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RNA抽提全过程(TRIZOL)

一，准备工作 1，实验器具与材料：

（1）移液枪：1ml、200ul、10ul（2）吸头：1ml、200ul、20ul

（3）吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4）EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）盐水瓶：100ml

（8）15ml塑料管一个（配75％乙醇用）

2，实验器具的处理与准备

（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）

将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。或直接购买经DEPC处理的枪头和EP管,每盒大约30元,基本上试剂公司都可以购买。

（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）

先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次（或180度干烤）。（3）金属制品：（镊子等）

先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）3，试剂配制和准备：

（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。

（2）75％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。（3）异丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶

（5）Trizol：100ml/瓶 存放于4℃

二，抽提时注意事项：

全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

三，抽提步骤 1． 匀浆化作用

取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。2． 分离阶段

每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。3． RNA的沉淀

将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20℃中1小时，后12000rmp离心10分钟。4． RNA的洗脱 小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。5． RNA的再溶解

小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。6，RNA的保存

提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。

TRIzol法抽提总RNA

组织100mg ↓

加1mlTRIzol ↓

研磨，匀浆（研磨时倒入液氮，研磨完后从研钵转入EP管中，）（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）↓

颠倒混匀10下，室温5分钟 ↓

加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）↓

颠倒混匀15S，室温5分钟 ↓

4℃，离心12000rmp，15分钟 ↓

转上层水相（约400-500μl）于另一新1.5mlEP管中（注意勿吸入中间那层）↓

加等体积异丙醇（约400-500μl）↓

4℃，离心12000rmp，10分钟 ↓

弃上清 ↓

加冰预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml ↓

4℃离心7500rmp，5分钟 ↓

弃上清，超净工作台开风机干燥约30分钟（不能完全干燥）↓

溶于DEPC水中至50μl（此处可按照实际情况修改，有人用50，也有人用100）（可在55-60℃水中，

立即保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录

RNA纯度检测及定量

从36μl中取6μl，用无RNA酶的水稀释100倍至600μl，用DU70型分光光度仪分别测定样品在260nm、280nm波长的光密度值，计算出RNA的浓度（μg/ml）。

纯RNA样品的A260/A280比值为1.7-2.1，若低于此值，表明存在蛋白质污染，需重新用酚/氯仿抽提。RNA样品的A260/A230比值应大于2.0，若低于该标准，提示有变性缓冲液残留需重新用乙醇沉淀RNA，然后用750ml/L的乙醇洗涤，以除去残留的变性缓冲液。

RNA电泳

用无Rnase水配TAE电泳液，称1.0g新开封的琼脂糖，加TAE电泳液至100ml，煮沸，加溴乙锭20μl，降至室温后灌胶置DEPC水处理过的电泳槽中，凝固20min，加TAE 缓冲液浸没胶块。取15μl RNA加6×RNA专用上样缓冲液3μl，混匀，用移液枪将样品加入上样孔内，待溴酚蓝迁移至理想位置后，终止电泳，紫外灯下观察、拍照。

上传RNA电泳条带如下

最下面条带代表5s 色浅代表RNA基本无降解

如出现拖把状条带 则为降解较严重情况

但有时这种情况也可以照样RT－PCR

我们同学就有在低温冰箱放了几个月的组织照样可以出结果的