胞浆蛋白核蛋白膜蛋白抽提试剂盒(真核细胞)_细胞蛋白提取试剂盒

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胞浆蛋白/核蛋白/膜蛋白抽提试剂盒(真核细胞)(Catalog #DBI-1021;DBI-1022;Store kit at 4℃)描述: 本试剂盒提供了蛋白抽提试剂A，蛋白抽提抽提试剂B，蛋白抽提试剂C 三种具有独特组分的缓冲液。所有试剂采用PIPES缓冲系统。通过实验，可以得到：

细胞胞浆蛋白（其中含有含有可溶性的骨架蛋白）； 细胞膜蛋白（其中包含细胞质膜蛋白和细胞器膜蛋白）； 细胞核蛋白；

其最后剩余的沉淀为难溶性的胞质骨架和纤维蛋白。

提取方法简单，可靠，快速。获得的各种部分蛋白纯度高，可用于PAGE 电泳、Western Blot、免疫共沉淀、EMSA等后续研究。该试剂盒所得到 的蛋白溶液适合用Bradeford法（DBI生物产品：DBI-1045,1046）蛋白定 量和BCA方法（DBI生物产品：DBI-1047,1048）进行定量。II 试剂盒组分: III.蛋白质抽提步骤: A.注意事项和试剂准备: • 打开试剂盒后，于4度保存蛋白抽提液；于-20度保存蛋白酶抑制剂，样品缓冲液（6×）。

• 使用前, 加10ul的蛋白酶抑制剂于1ml蛋白抽提试剂A中，使成为蛋白 抽提混合试剂(该混合物被称为Extraction Buffer Mix ——A)；加 2ul的蛋白酶抑制剂于200ul蛋白抽提试剂B中，使成为蛋白抽提混合 试剂(该混合物被称为Extraction Buffer Mix ——B)；加2ul的蛋白酶 抑制剂于200ul蛋白抽提试剂C中，使成为蛋白抽提混合试剂(该混 合物被称为Extraction Buffer Mix ——C)； 试剂盒组分

DBI-1021 DBI-1022 包装 50 次100 次颜色 蛋白抽提试剂A 蛋白抽提试剂A-1 蛋白抽提试剂B 蛋白抽提试剂C 混合型蛋白酶抑制剂(100×)SDS-PAGE 样品缓冲液(6×)50ml 500ul 50ml 25ml 1支 5支 100ml 1000ul 100ml 50ml 1支 10支 棕色 棕色 棕色 棕色 棕色 绿色

• 在试验过程中确保抽提混合物始终保存在在碎冰中。• 需要自己提供的试剂：90% acetone，PBS 抽提所使用的蛋白抽提试剂使用量 抽提步骤 Ⅰ.准备细胞

1.将培养好的细胞用预冷的PBS 清洗2-3 次。

2.选择合适的方法进行悬浮细胞和贴壁细胞的蛋白抽提：

如果样品为悬浮细胞；蛋白抽提试剂的使用量依赖于培养细胞的湿重或细 胞数量。

a)转移悬浮细胞培养液到一个预先称重的离心管中，简单的离心。b)弃去上清培养基，称量其重量，计算出悬浮细胞的重量。c)按照实验II 进行下面的实验。

如果样品为单层贴壁细胞： 蛋白抽提试剂的使用量取决于培养细胞 的器皿大小或细胞数量。

a)按照实验III 进行下面实验。

Ⅱ.悬浮细胞蛋白抽提实验步骤

1.吸取取5 倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂A，加入到已经清洗好的细胞 沉淀中。用移液器小心吹打，使细胞悬浮。

2.冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约10 分钟。使95-100%的细胞 胞浆流出细胞。

注意：在实验过程中，每个步骤的时间要保持连贯性。3.以480g 的离心速度，4 度离心10 分钟。

4.转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为胞浆蛋白。（标 记为上清1）。于-70℃保存该样品。.5.吸取取3 倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂B，加入到沉淀中。用移液器 小心吹打，使沉淀悬浮。

6.冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约30 分钟。7.以5000g 的离心速度，4 度离心10 分钟。

8.转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞质膜蛋白。（标记为上清2）。于-70℃保存该样品。

9.吸取取1.5 倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂C，加入到沉淀中。用移液器 小心吹打，使沉淀悬浮。.漩涡混合器上高速振荡30 秒，或转移到玻璃 匀浆器中高速匀浆30 秒。

10.以6780g 的离心速度，4 度离心10 分钟。

11.转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞核蛋白。（标记为上清3）。于-70℃保存该样品。

Ⅲ.单层贴壁细胞的蛋白抽提

对于贴壁细胞，用细胞刮将细胞刮掉，用PBS 清洗细胞3 次。600g，离 心5 分钟，收集细胞。下面实验适用于约5×106 个细胞。

1.吸取取1ml 的蛋白抽提试剂A，加入到已经清洗好的细胞沉淀中。用移 液器小心吹打，使细胞悬浮。

2.冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约10 分钟。使95-100%的细胞 胞浆流出细胞。

注意：在实验过程中，每个步骤的时间要保持连贯性。3.以480g 的离心速度，4 度离心10 分钟。

4.转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为胞浆蛋白。（标 记为上清1）。于-70℃保存该样品。.5.吸取取500ul 蛋白抽提试剂B，加入到沉淀中。用移液器小心吹打，使沉 淀悬浮。

6.冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约30 分钟。7.以5000g 的离心速度，4 度离心10 分钟。

8.转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞质膜蛋白。（标记为上清2）。于-70℃保存该样品。

9.吸取250ul 蛋白抽提试剂C，加入到沉淀中。用移液器小心吹打，使沉淀 悬浮。.漩涡混合器上高速振荡30 秒，或转移到玻璃匀浆器中高速匀浆30 秒。

10.以6780g 的离心速度，4 度离心10 分钟。

11.转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞核蛋白。（标记为上清3）。于-70℃保存该样品。

Ⅳ.蛋白浓度测定

可使用BCA 定量法（DBI-018）和Bradford(DBI-016)进行蛋白浓度测定。具体程序请参照相关说明书。

该试剂盒所获的的相关部分蛋白质是进行后续实验的最佳蛋白来源。

1.该试剂盒所获的的相关部分蛋白质浓度很高，可以用相关的缓冲液进行稀 释使用，因此最大限度的避免了去垢剂的影响。

2.该试剂盒中的蛋白抽提试剂可以和各种蛋白酶抑制剂混合使用，而不影响 其抽提效果。

3.利用该试剂盒所得到的蛋白抽提液以成功用于SDS-PAGE，WB，EMSA，IP 等各种实验，蛋白抽提试剂中的去垢剂完全不影响实验。