RNA的抽提及RNA的甲醛变性电泳实验~（优秀）_rna甲醛变性胶电泳

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【1】？1 SP免疫组化，HE染色PTEN Phosphatase and tension homologue deleted on chromosome ten 第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因 3 TMA ．tiue microarrays 组织微阵列法 4

目前研究表明多种恶性肿瘤的发生发展与细胞周期调控机制的失衡相关，细胞周期的调控是指各种调控因子通过自身的激活和灭活使细胞启动和完成细胞周期 保证这些事件按次序正常进行。细胞周期主要的调控因子包括细胞周期蛋白(Cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin．dependent kinases，Cdks)，对细胞周期有正调控作用；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin．dependent kinases inhibitor,Cdki)，通过与cyclin．cdk形成稳定的复合物，对细胞周期起负调控作用。p27脚1是Cdki家族中的一员，可抑制细胞增殖，阻断细胞生长，对细胞周期的调节起着重要的负调控作用。S期激酶相关蛋白2(s．phase kinase．aociated protein2，Skp2)是泛素连接酶复合物的底物识别亚基，能特异性识别磷酸化的底物并介导其泛素化降解，许多细胞周期调控因子都是泛素蛋白酶体途径的底物，其中最主要的是p27脚1。现在许多研究表明多种肿瘤中Skp2蛋白的高表达、p27l(ipl蛋白低表达可能与PTEN(第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因，phosphatase and tension homologuedeleted on chromosome ten)的调节有关。PTEN是迄今发现的第一个具有双重特性磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，是P13K／Akt信号通路的主要负性调节因子，主要功能有参与胚胎的正常发育，诱导细胞凋亡、抑制细胞生长，抑制端粒酶的活性。研究发现PTEN可通过其磷酸酶活性诱导细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子p27ⅪP1的产生，从而负性调控细胞周期。

p27kip1是CDK抑制剂Cip／Kip家族中的一员，可以和cyclinE-cdk2和cyclinA-cdk2结合，从而阻止细胞周期中G1期到S期的转变【7，8】。实验表明p27kip1蛋白的表达水平在多个肿瘤中是降低的，但它并没有蛋白合成的减少或基因的变异，研究发现p27kip1蛋白的减少主要是转录后通过泛素蛋白酶体途径降解的【9，10】。p27kip1蛋白的泛素化及随后的蛋白酶体降解途径对许多细胞活动有着调节作用，包括细胞周期的进展、细胞的生长与分化等。

PTEN是迄今发现的第一个具有双重特性磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重特异性，在细胞内多条信号传导途径调控中起着重要作用，自发现以来受到众多学者的关注。PTEN脂质磷酸酶的活性可使磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositol-3，4，5．triphosphate，PIP3)去磷酸化转变为磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinosit01．4，5．triphosphate，PIP2)而失活，继而抑制P13K／AKT通路，抑制细胞的生长、调控细胞周期【21】。过去认为PTEN蛋白主要定位于细胞质，现研究发现PTEN亦可存在于胞核，且不同的亚细胞定位可能与PTEN蛋白的功能及某些肿瘤的发生有关。胞质PTEN主要参与诱导细胞凋亡，胞核PTEN蛋白可下调细胞周期素D1、阻止丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化，阻止细胞通过GO/G1【22,23】，亚细胞定位的改变可能是肿瘤形成的首要步骤。

p27kip1是Cdki的典型代表，cyclin-cdk2复合体使其187位苏氨酸磷酸化，Skp2特异作用于磷酸化的p27kip1，使其通过泛素蛋白酶途径降解。mamillapalli R【24】等体外研究试验证实PTEN可以负性调节Skp2的表达水平，使p27kip1水平升高，且Skp2的异位表达足可逆转PTEN介导的p27kip1的积聚。Jonason【25】通过RNAi技术沉默cyclinDl，则在共表达PTEN和Skp2的情况下，p27kip1蛋白的泛素化降解受到抑制，从而证实PTEN／PI一3激酶可以通过以下两种途径调节p27kip11的水平：一条是直接影响Skp2的转录；另一条是通过下调cyclinDl蛋白而影响SCF—Skp2复合物的构成，影响G1期至S期的转变。