ELISA原理及步骤(附教学视频)_elisa步骤及原理

ELISA原理及步骤(附教学视频)由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“elisa步骤及原理”。

ELISA的操作步骤

教学视频：http://v.youku.com/

方法一：用于检测未知抗原的双抗体夹心法：

1.包被：用0.05M PH9，碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

方法二：用于检测未知抗体的间接法：

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30～60分钟，洗涤，最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

酶联免疫分析技术(ELISA)

一、酶联免疫分析的基本原理和方法类型

1971年瑞典学者Engva11, 荷兰学者Van Weerman等分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent aay, ELISA)。其基本原理与RIA相同。先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。

ELISA可用于测定抗体，也可用于检测抗原。根据检测目的和操作步骤不向，有以下三种类型的常用方法。

1.间接法

此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。见下图：

操作步骤：

①用已知抗原包被固相载体； ②加待检标本，经过温育(37℃2h)，使相应抗体与固相抗原结合。洗涤，除去无关的物质；

③加酶标抗抗体．再次温育(37℃2h)与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体；

④加底物显色。终止反应后，目测定性．或用酶标仪测光密度值定量测定。

2． 双抗体夹心法

此法常用于测定抗原。将已知抗体吸附于固相载体．加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。见下图：

操作步骤： ① 用已知特异性抗体包被固相载体； ② 加待检标本，经过温育使相应抗原与固相抗体结合；洗涤，除去无关的物质； ③ 加酶标特异性抗体，与已结合在固相抗体上的抗原反应；洗涤，除去未结合的酶标抗体； ④ 加底物显色。终止反应后，目测定性或用酶标仪测量光密度值进行定量测定。

此法适用于多价大分子抗原的检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。

3． 竟争法

此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。

以测定抗原为例．将持异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。见下图：

操作步骤：

① 用已知特异性抗体包被固相载体； ② 测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原，经过温育，使二者与固相抗体竞争结合；对照管只加一定量酶标抗原．与固相抗体直接结合。分别洗涤，除去未结合的成分； ③ 加底物显色。

对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物显色反应较弱。分别测定两管的光密度(OD)值，根据对照管与测定管OD值之比．计算标本中待测抗原含量。

二、ELlSA方法的技术要点

1． 固相载体和免疫吸附剂的制备

ELISA法最常用的固相载体是聚苯乙烯，其对蛋白质有较强的物理吸附性能，不影响抗体和抗原的免疫活性；且价格低廉，并可制成各种形状的制品。

与固相载体结合的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被(coating)，由于载体不同，包被的方法也不同。使用聚苯乙烯制品为载体一般多采用物理吸附法。除载体的理化性质外，受缓冲液的离子强度、pH值、包被时的温度和时间等多种因素的影响。

很多蛋白质、细菌脂多糖、脂蛋白、糖脂及变性的DNA等均易吸附在聚苯乙烯表面。用于包被的蛋白质浓度一般为1-10μg／m1，每个凹孔内加100—200μl。包被液的蛋白量过大，可能会造成蛋白质分子的多层化．在洗涤时一部分蛋白分子容易被洗掉。包被用抗原或抗体的最适工作浓度，最好是预先经过选择。

用抗原或抗体包被后。固相载体表面往往尚残留少量未饱和的吸附位点。其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地被非特异吸附，导致本底偏高。为此．常用1％—5％BSA，或含5％—20％小牛血清的pH9.6碳酸盐缓冲液注满凹孔，37℃作用1h，可以消除此种干扰。这一过程称为封闭(blocking)。2． 抗原和抗体

如同免疫荧光技术和放射免疫测定一样，用于制备酶标记物和包被固相载体的抗原要求纯度高，抗原性完整；抗体需特异、效价高、亲和力强，并具有较高的比活性。如将抗体IgG用木瓜蛋白酶水解为Fab片段，再与酶连接，可以减少非特异性吸附，检测效果更佳。McAb的应用，进一步提高ELISA法的特异性和灵敏度。使用针对抗原分子中不同决定簇的两种McAb分别作为固相抗体和酶标抗体用于双位点夹心法，测定时可以将待检标本和酶标抗体同时加入，简化了操作程序。通常采用特异性较高的McAb作为固相包被抗体，与酶标记的多克隆抗体相结合进行检测，结果更为满意。

3、常用的酶及其底物

在ELISA法中，用于标记抗体或抗原的酶与免疫酶组织化学技术基本上相同。但所用底物被酶裂解后，应能生成可溶性有色产物，适合用分光光度计(酶标仪)测量光密度值，籍以定量测定样品中待捡抗原或抗体的含量。常用酶及其底物见表下：