分子生物实验报告及讨论_分子生物实验报告
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蛋白质SDS-PAGE分离和Western Blot
一、实验目的1． 掌握SDS-PAGE分析的原理和技术，应用于蛋白质的分析和鉴定。
2． 实验采用HL60细胞总蛋白作为材料，进行SDS-PAGE后，用半干式转移法将蛋白质转移到PVDF膜上，应用Western Blot分析技术，分析PVDF膜上的c-Myc蛋白。通过本实验，掌握半干式转移的操作和Western Blot的基本原理和操作技术。
二、实验原理
1.蛋白质SDS-PAGE原理
聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺和交联剂亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合而成。化学聚合的催化剂通常多采用硫酸铵或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，最有效的加速剂为N,N,N’,N’,-四甲基乙二胺（TEMED），在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成的氧自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合作用。聚丙烯酰胺凝胶的机械强度好，有弹性且透明，相对的化学稳定，对PH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变动在极广范的范围，并且之制备凝胶的重复性好。
聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE分离蛋白质的方法有很多种。本实验采用SDS-PAGE法。SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS/1g 蛋白质。由于十二烷基硫酸根带负电，是各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则随蛋白质的分子量成正比的变化。这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分力量的函数。不同的凝胶浓度合适用于不同的分子量范围，可根据所测分子量范围选择最适合的凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样本相近的蛋白质作为标准蛋白质。
并非所有的蛋白质都能用SDS-PAGE测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。这些蛋白质有：电荷异常或构象异常的蛋白质、带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白。2.Western Blot原理
Western Blotting是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应以及显色系统分析此印记。经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移至固相载体（如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能 保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检查电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。Western Blotting一般分五个步骤：
（1）固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE并从凝胶上转移到PVDF膜上。
（2）封闭：封闭膜上没有特殊抗体结合的场所，使其处于饱和状态，以减少非特异性结合。（3）第一抗体与抗原的特异性结合。
（4）第二抗体或配体试剂与第一抗体的特异性结合并作为指示物。
（5）被适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。本实验采用HL60细胞总蛋白作SDS-PAGE，经半干式转移将电泳所分离出的蛋白条带转移到PVDF膜上，用兔抗人c-Myc多克隆抗体作为第一抗体与c-Myc蛋白发生反应，然后用碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG作为第二抗体与第一抗体结合，经过显色底物的显色检测c-Myc蛋白。
三、实验器材和试剂 详见实习指导。
四、实验步骤
1.安装并组装夹板，依次灌制分离胶和浓缩胶。2.上样电泳。
3.裁剪胶体2cm*7cm两份，一份用考马斯蓝染色，最后脱色观察结果。4.上述另一份样本经半干式转移至PVDF膜上，转膜后封闭 5.依次与第一抗体和第二抗体结合，显色。
五、实验结果
1.蛋白质SDS-PAGE结果 相比于marker带，样本带为HL60细胞中总蛋白所电泳出的条带，由于总蛋白中各蛋白质分子量各异，故所形成的SDS-蛋白质复合物的椭圆棒长度各异，进而电泳后出现多个距离相近的条带，下一步Western Blot所检测的c-Myc蛋白亦在其中。
而marker和样本总蛋白条带均比较宽而模糊，原因为染色后存放时间太久，凝胶存在一定的孔径，SDS-蛋白质复合物于凝胶中向周围扩散，染料亦扩散，最终使条带不集中和清晰。2.Western Blot结果
样本带中红色的条带为显色的c-Myc蛋白条带。其处于marker第二和第三条带之间，分子量符合预测结果（一般于SDS-PAGE上表观分子量为62KD）。而显色结果不理想，其原因在后文中有详细讨论。
六、注意事项
1.聚丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性。称量聚丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺时应带手套和面具。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因可能会含有少量未聚合材料。
2.SDS的微细晶粒易于扩散，称量时要戴面罩。称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS。SDS溶液无需灭菌。
3.用封口机密封塑料袋时要尽量排除藏匿的气泡。
4.拿取凝胶、Blotting Paper和PVDF膜时必须戴手套，因为皮肤上的油脂和分泌物会阻止蛋白质从凝胶向滤膜转移。
5.封闭液的作用是封闭未吸附蛋白的部位，以减少非特异性结合背景的影响。
6.PBST是一种磷酸钾、钠盐溶液，既可稳定蛋白质固定于PVDF膜上，同时又可以洗去多余的封闭液及其杂质。Tween-20是一种非离子型的蛋白去污剂，它可以出去免疫探针的非特异性结合，使免疫反应背景更加清晰。
7.转移过程中电压不应大于50V，若电泳初始电压大于20V，则应检查离子强度对不对，若转移过程中电压增加幅度大于10V或温度增加，则表示buffer感和，此时应停止电泳，多加几层湿的blotting paper。8.PVDF膜最好一次放到位。
9.Westing Blot可检测出1-5ng中等大小的蛋白质。
七、实验讨论
1.配胶缓冲液系统对电泳产生的影响？
在SDS－PAGE中，加入缓冲液后，浓缩胶中pH环境呈弱酸性，甘氨酸解离很少，在电场的作用下泳动效率低。而氯离子浓度却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，使蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加而呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，紧随氯离子之后。同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
综上可见，环境pH对整个反应体系的影响至关重要，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。2.配制凝胶的注意点？
使聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。勿即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。可待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。
3.凝胶时间不对，或慢或快的原因？
通常胶在30min—1h内凝固。如果凝的太慢，可能是TEMED或APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。4.电泳条带出现“微笑”、“皱眉”或拖尾现象的原因及处理方法？ “微笑”状条带即为两边翘起中间凹下的形状。主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中，可待其充分凝固再作后续实验。
“皱眉”条带即为两边向下中间鼓起的形状。主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净，可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
拖尾现象主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理方法如下：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
5.什么是“鬼带”，如何处理？
“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。6.电泳的条带很粗的原因？
电泳中条带很粗较常见，主要是未浓缩好。其处理办法为适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压等。
7.浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？ 前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。一般对电泳不会有太大的影响。8.电泳时间比正常要长的原因？
可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。9.背景过高的原因及解决办法？
背景过高可能原因如下：1）抗体浓度过高； 2）封闭液选择不当； 3）封闭不完全； 4）抗体与封闭液中其他蛋白发生交叉反应；5）清洗不充分； 6）曝光时间过长； 7）膜出问题；8）缓冲液污染或长菌9）仪器污染。其相应的解决办法为：1）降低抗体（一抗/二抗）浓度；2）比较不同封闭液供进一步选择；3）根据不同的体系优化封闭液，提高封闭物浓度，优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜，在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20，用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体；4）更换封闭液，封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测；5）增加清洗次数及清洗液体积，如果之前未添加Tween-20，可添加Tween-20至终浓度0.05%；6）缩短曝光时间；7）确保转膜前，根据指导将膜彻底浸润；更换新膜，确保膜始终有足够的液体覆盖避免干掉，避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子，每一步孵育都应确保充分；8）重新配制缓冲液；9）确保转膜仪、杂交仪等仪器清洁无污染，确保转膜后膜上没有残留的胶。
10.转膜不充分的原因和解决办法？ 转膜不充分的可能原因如下：
1）膜没有完全均匀湿透；2）靶蛋白分子量小于10,000；3）靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH 值；4）甲醇浓度过高；5）转移时间不够。其分别的解决办法为：
1）使用100%甲醇浸透膜；2）选择小孔径的膜，缩短转移时间；3）可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液；4）过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替；5）对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间。
11．没有阳性条带或阳性条带比较弱的原因及解决办法？ 无阳性条带的原因：
1）抗体染色不充分；2）酶活性降低或失活；3）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低；4）试剂不匹配；5）抗体活性降低或失效；6）封闭过度；7）曝光时间过短。其分别的解决办法为：
1）增加抗体浓度，延长孵育时间；2）直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物；3）设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。；4）一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性；5）选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液；6）减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型；7）延长曝光时间。12.原因：
1）二抗的非特异性结合；2）一抗的特异性不够；3）蛋白降解；4）二聚体或多聚体存在；5）抗体浓度过高；6）蛋白上样量过大。其解决办法为：
1）增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）；2）使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性；3）使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂；4）增加蛋白质变性过程及强度；5）降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带；6）降低上样量。
