海岛棉综述吴凯凯终_图像增强综述终稿
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新疆农业大学
专业文献综述
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国内海岛棉转基因育种的应用及建议
吴凯凯
农学院
生物技术
122班
123135225
苏豫梅
职称: 讲师 2015 年 3 月 22 日
新疆农业大学教务处制
国内海岛棉转基因育种的进展及建议 吴凯凯 指导老师：苏豫梅
摘要:通过介绍国内转基因技术在海岛棉育种上的应用,指出了在关键技术上还未建立起系统的遗传转化体系,转化基因较为单一等存在的问题;新疆作为我国唯一的海岛棉产区,优越的自然生态条件为新疆海岛棉的发展提供了得天独厚的发展优势，虽然前人利用传统育种手段通过杂交、回交和聚合杂交在改良纤维品质方面取得了较大进展，但也存在后代农艺性状差、难于稳定、育种周期长等问题。因此到目前为止农杆菌介导法、回交转育法是获得转基因新材料的最有效方法，同时也简要的介绍农杆菌介导法、花粉管通道、基因枪轰击法以及回交转育法的应用，并对新疆在开展转基因海岛棉新品种选育方面也提出了建议。
关键词:转基因技术;海岛棉;农杆菌介导；花粉管通道；基因枪轰击
转基因技术作为现代生物技术改良作物的重要手段之一,已被广泛应用于生产并得到验证。1983年,世界上第一例转基因植物——含有抗生素药类抗体的烟草在美国成功培植,拉开了转基因改良作物的序幕[1]。在棉花领域,自1987年美国Racetracks公司科学家通过基因工程手段首次获得转At基因的抗虫棉株以来[2],国内外已经创造出较多具有抗虫、抗除草剂等新性状的转基因陆地棉新品种(系)[3],对促进世界棉花生产起到了一定的推动作用。1 主要外源基因转化技术及进展 1.1 农杆菌介导法
农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系,农杆菌介导的遗传转化是目前植物基因工程研究中最常用的方法,现在成功转化的植物实例中有80%左右是通过农杆菌介导实现的[4]。农杆菌介导法与其他转基因方法相比,具有转化机理清楚、转化率高、方法成熟、转育周期短和遗传稳定快等特点。
在国内农杆菌介导转基因方面,1994年新疆农业科学院核生物技术研究所和塔里木农垦大学分别对海岛棉体细胞胚状体的发生及胚性细胞悬浮系的建立、外源DNA导入海岛棉引起性状变异进行了研究,摸清了海岛棉胚性愈伤组织诱导条件,获得了6个海岛棉品种胚性愈伤组织和转导DNA后的变异后代[5]。新疆农业科学院郝秀英在棉花茎尖多芽发生方面获得了完整棉花再生植株,并建立了多芽发生再生体系,筛选出了诱导芽生根的培养基,解决了海岛棉组织培养诱导过程中出现的外植体褐化问题[6]。翁琴等[7]对海岛棉的茎尖采用根瘤农杆 LBA4404和EHA105介导,筛选出再生效果好的激素组合,另获得了较高转化频率的海岛棉培养条件和7株抗虫(At、SATI)植株。贺雅婷等[8]以海岛棉品种新海16号无菌苗下胚轴为外植体材料,获得了较好的诱导愈伤组织及分化配方,分化率达到88%,并通过体细胞胚胎发生途径获得了海岛棉再生植株。李琼等[9]以海岛棉新海20号和新海24号为受体,通过农杆菌介导胚性愈伤进行p53抗病基因的遗传转化,并针对第1代转化植株进行了PCR和Southern检测,显示外源基因已整合到棉花基因组中。周丽容等[10]以新海30号和新海16号的胚性愈伤组织为转化受体,通过第1代PCR及第2代RT-PCR检测证实At基因已整合到海岛棉基因组中,获得转基因植株。在国外,据李琼报道,Ella及Kandahar(2000)曾对不同棉种间体细胞胚胎发生能力进行比较,并成功获得海岛棉再生植株;Humidor.Sakharov(2001)针对Lima棉的胚性愈伤组织高频率诱导和植株再生进行了研究,但研究对象过于单一,因此,获得的体系,其广谱性需要进一步探讨。1.2 花粉管通道法
花粉管通道法介导的遗传转化是一种借助于植物自身的种质细胞卵细胞或受精卵为转化对象的直接转化技术。通过花粉管通道法的转育可以直接获得转基因棉花种子。其操作简便,省工省时,不需要棉花组织培养和诱导再生棉株等人工培养过程,避免了基因型依赖性和组织培养中产生的体细胞变异,对所有的棉花受体材料均可以进行转化,且转化速度快。
在国内,花粉管通道法转化成功的例证也较多。王中军等[11]将海岛棉吉扎20总DNA导入到军海1号中,在第2代出现多株一柄双铃单株。宁新民等[12]通过研究海岛棉转At基因的导入方法,使海岛棉转基因成铃率得到较大高,2005年选育出了9株抗虫棉株,2008年进一步系统选育出了9份遗传较稳定的抗棉铃虫高代材料。李琼等以海岛棉新海20号为受体,采用农杆菌菌液喷雾法获得了转p53抗病基因第1代材料,并使成铃率(达到30.6%)得到较大提高。马盾等[13]通过改良花粉管通道导入技术,使海岛棉HB-1转基因成铃率达到56%,大大提高了外源DNA的转化率,获得了高表达率的转GHABC1基因、HAN基因棉花植株,为进一步开展相关研究及转基因品种筛选工作奠定了基础。新疆农业科学院长绒棉育种组获得2份转基因抗盐新种质。
花粉管通道法受棉花花期和环境条件影响较大,对技术操作也有一定要求。其基因第1代转化率较低,据笔者多年研究,在海岛棉中一般为0.3%左右。此外,供体DNA片段的纯度对转基因棉株的获得及后代的表型有一定影响,DNA纯化过程中保持DNA片段的完整性十分重要。1.3 基因枪轰击法
基因枪法(Particle gun),又称微弹轰击法(Micro-projectile bombardment),是依赖高速度的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术。其原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面,然后在高压的作用下微粒被高速射入受体组织或细胞,微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到植物染色体上,并得到表达,从而实现基因的转化[14]。在国内,黄全生等[15]采用基因枪法对海岛棉茎尖组织进行轰击,经Southern点杂交获得了2株转蜘蛛丝蛋白基因(ADF3)材料。吴敬音[16]、罗小敏等[17]以棉花茎尖分生组织为受体进行轰击,均获得了数株抗生素抗性转化植株。耿立召等[18]、于娅[19]利用棉花茎尖分生组织进行轰击转化,经PCR检测,获得转化率分别为0.65%和0.54%的抗性植株。在国外,Carl等[20]采用棉花茎尖分生组织为受体转化APTⅡ基因,获得经过蛋白质分析的抗性植株,[21]转化率为0.885%～3.54%。Allegra,Lorre等,提出多茎尖诱导法,可在一定程度上提高基因枪转化法的转化效率。
该项导入技术不受导入作物基因型种类和被导入作物器官的限制,但转化的可靠性差,整合效率较低,稳定遗传表达效率在所有外源基因导入技术中也是最低的。
1.4 回交转育法
该方法通过与轮回亲本回交,可保持轮回亲本的优良性状,增添非轮回亲本的目标性状,是改良培育新品种的有效方法。通过利用配合力好、表达量高的转基因抗虫棉(除草剂)品种(系)与海岛棉常规品种杂交,再利用海岛棉品种进行回交,并对后代进行鉴定和强化筛选,最终获得稳定的高表达量的抗虫、抗除草剂的海岛棉材料。
新疆农业科学院长绒棉育种组以抗虫陆地棉品系3331为父本,强抗病材料S03为母本于2004年配置海陆杂交组合,经过多代南繁北育,并进行回交,筛选出新品系K-2021,该品系经田间鉴定、室内棉铃虫饲喂及分子鉴定,已经稳定遗传表达。另获得了多份高代抗虫、抗除草剂育种材料。在陆地棉领域,河南省南阳市农业科学研究所以宛棉5号为母本,以转基因抗虫棉GK22为父本进行杂交,杂交一代经NaN3诱变处理,选育出棉花新品种“宛棉10号”。国内以抗虫棉育种中间材料SGK-27为母本,以品系922047和中394为父本杂交,结合生化辅助育种技术,选育出“中棉所58”和“中棉所64”。表明采用回交转育法培育出抗病虫、抗除草剂转基因棉花是完全可行的。2 海岛棉转基因育种存在的问题及建议 2.1 存在的问题
2.1.1 在技术层面上 从总体来看,国内海岛棉转基因育种工作较为薄弱和松散,特别是在关键技术上还未建立起系统的遗传转化体系,转化尚未形成规模。
在国内,多数科研单位主要在转基因陆地棉转化体系、鉴定筛选等方面积累了许多有益经验。因分布区域及种植规模等方面原因,除新疆部分科研单位外,国内在海岛棉转基因领域研究较少。海岛棉和陆地棉分属不同栽培种,在生物学特征特性、遗传规律等方面与陆地棉均具有较大差异。在转基因方面,多数技术均借鉴陆地棉形成的科研成果结合海岛棉品种实际逐步探索,育种技术研究的投入不足、进程较为缓慢,并缺乏深入研究。
2.1.2 在转化基因上 转化基因较为单一,多以抗棉铃虫、抗除草剂为主。对生产中急需的抗病、抗盐碱、抗旱等方面少有研究进展缓慢。
2.1.3 在人才力量方面 新疆在人才方面与内地相比缺乏优势。虽然国家近年对农业生物技术的扶持力度较大,对新疆棉区进行了一定支持,培养了一批转基因人才,但尚缺少顶尖领军科技人才,在核心团队建设方面尚未形成合力,研究较为分散,生物技术与传统育种相结合是今后发展方向,必须要有熟悉生物技术和懂传统育种的综合性人才,才能有效开展此项工作。
2.1.4 在政策管理上 基于转基因生物安全等问题,国家一直没有在政策层面允许转基因棉在新疆的推广种植,在转基因技术及材料创新方面管控严格,这在一定程度上影响了新疆转基因海岛棉品种的研发工作。3 总结及建议
一是建议国家在转基因项目上继续加大扶持新疆棉区科研育种单位的力度,积极鼓励国内高等院校、科研院所在基因克隆、转化技术研究等方面开展对口援建和扶持工作,在人才培养等方面逐步向新疆棉区倾斜,特别是加强对中青年转基因科技人才的培养。
二是通过联合攻关等方式,应尽快摸清海岛棉生物学特征特性、遗传发育规律,明确与陆地棉的区别,为遗传转化提供科学依据。
三是新疆区内应尽快制定关于转基因研究的管控体系,明确一般性研究和生产推广的区别,支持开展技术性储备研究,严格跟踪监督并加强田间释放的管控,使转基因育种工作在安全、可控的范围内迅速展开。
四是为了能加快海岛棉的研究，希望能建立一套更加完整的试验体系以及做好相关安全的防护和监督。参考文献: [1]刘杨.转基因产品法律规制WTO[D].大连海事大学硕士学位论文,2006.[2]Perl F J,Atone RW,Armstrong TA,ET AL.Insect resistant cotton plants[J].Biotechnology, 2003(8):939-943.[3]倪万潮,郭三堆,贾士荣.花粉管通道法介导的棉花遗传转化[J].中国农业科技导报，2000,2(2),27-32.[4]王孝纲,别墅,张教海等.我国转基因棉花育种概况与展望[J].湖北农科学，2003，(3):32-35.[5]黄乐平,马盾,李建平等.新疆转基因棉花育种方法初探[J].新疆农业科学，2003,40（3）:170-171.[6]孙国清,李雪源等.新疆转基因棉花育种研究现状[J].分子植育种,2004,2(1):129-132.[7]翁琴,陈全家,孔庆平等.农杆菌介导的海岛棉茎尖再生体系及其遗传转化影响因子的研究[J].新疆农业大学学报,2007,30(4):63-67.[8]贺雅婷,曲延英,孔庆平等,海岛棉愈伤组织诱导及分化的影响因素初探[J].分子植物育种,2008,6(3):597-602.[9]李琼.棉花体细胞胚胎发生机制研究及p53基因的遗传转化[D].新疆农业大学硕士论文, 2012.[10]周丽容,陈全家,贺雅婷等.农杆菌介导海岛棉胚性愈伤高效遗传转化体系的研究[J].新疆农业大学学报,2011,34(4):317-320.[11]王中军,宁新民,陈冠文等.外源DNA导入棉花生物技术育种初探[J].新疆农业科学, 1998,(3):111-113.[12]宁新民,孔庆平,阿里甫等.新疆海岛棉抗虫转基因棉花的筛选及抗虫鉴定[G].中国棉花学会2009年年会论文汇编,2009,121-124.[13]马盾,黄乐平,黄全生等.提高棉花花粉管通道法转化率的研究[J].西北农业学报,2005, 14(1):1O-12.[14]王关林,方宏筠.植物基因工程[M].北京:科学技术出版社,2002.[15]黄全生,刘霞,王义琴等.基因枪轰击法将蜘蛛丝蛋白基因(ADF3)转入海岛棉的研究[J].新疆农业科学,2004,(4):248-250.[16]吴敬音,朱卫民,佘建明等.陆地棉(Symposium hirsute L.)茎尖分生组织培养及其在基因导入上的应用[J].棉花学报,1994,6(2):89-92.[17]罗小敏.棉花组织培养与雪花莲凝集素基因转化[D].河北大学硕士学位论文,2004.[18]耿立召.棉花基因枪遗传转化体系建立[D].中国农业科学院硕士学位论文,2004.[19]于娅.棉花基因枪转化体系的建立(以茎尖分生组织和胚性愈伤组织为轰击受体)[D].河北农业大学硕士学位论文,2003.[20]Capillary,Jun min L,Jefferey.Procedure probabilistic transformation and regeneration of transgenic cotton frozen-aftermaths tiue[J].Molecular Reports,1995,13(1):31-37.[21]Allegra D C,Baneful AK,Koala R R,ET AL.In vitriol induction of multiple shoots and plant regeneration in cotton(Symposium hirsute L.)[J].Plant Cell Reports,1997,(16):647-652.
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