脂质立方相结晶膜蛋白_跨膜蛋白结晶

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脂质立方相结晶膜蛋白（lipid cubic phases for membrane proteins crystallization）

(2011-08-26 15:09:39)标签：

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膜蛋白是组成细胞的最基本的成分之一，具有十分重要的生理功能。细胞中膜蛋白占据了所有蛋白总量的30%。膜蛋白参与到大量的生命活动过程中，如离子和营养物质的转运，免疫反应，能量的转换，信号传导等关乎生物活性最基本的过程。对于人类来说，膜蛋白的功能障碍会导致大量的疾病，例如，阿兹海默症，癌症，帕金森综合症，糖尿病，心脏病等等。除此之外，膜蛋白还是目前市场上1/3-1/2的药物的靶点。

多年来，膜蛋白的在功能上的重要性基本上已经阐释清楚，然而，对膜蛋白的三维空间结构信息却知之甚少。目前，PDB数据库里已知结构信息的膜蛋白不足250个，膜蛋白研究的难度可见一斑。了解膜蛋白的三维空间结构对人类的健康和科学的发展具有十分重大的意义。因此，在这里我通过收集整理资料推荐了一种膜蛋白结晶很实用的方法Lipid cubic phase，仅供有识之士参考。

脂质的多态性（Lipid polymorphsim）

首先，在讲lipid cubic phase之前我想讲一下lipid polymorphsim，即脂质的多态性。磷脂双分子层是我们最熟悉的磷脂的形态排列方式。但是，磷脂可以以各种不同的形态进行排列，liposomes，small liposomes，或者bicontinuous cubic phase。此外，磷脂还可以形成弯曲的单脂层，例如，六角相，甚至会聚集成椭球形的微球（micelles）。脂质的最终形态取决于很多因素，包括脂质的结构、脂质基团的特性、温度以及脂质的水化程度。脂质的多态性可以应用到细胞膜双分子层的基本生理特征的研究，转而可以研究膜蛋白的功能特性。

1.脂质相lipid phase

纯的磷脂能够经历从一种或者多种形态到另外一种形态的转变，这就是我们所说的多态性。脂质相主要可分为两种：正相脂质和反相脂质。正相脂质是指脂类的极性部分朝外，而分子的非极性部分组成了脂类结构的中心。相反，反相脂质的极性部分朝向内部，而非极性部分占据着整个结构的外表面。正相脂质和反相脂质也被称作I型脂质和II型脂质。

1.1 脂双分子层or层状相（bilayers/lamellar phase）

在生物膜里面的脂类，不出意外的话，主要以脂双分子层的形式存在。有时也把双分子层叫做层状相，以此来区分双连续的立方相，因为在立方相里面脂类也以双分子层的形式排列。不同点是立方30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 相是一个三维结构，而一般的双分子层都是一个平面二维结构。脂质在水化时形成平面双分子层，同时不断地堆积和叠加形成多层囊泡脂质体（MLVs）。因此，这些平的双分子层通常叫做层状相，他们与立方相有所区别。

MLVs多层囊泡脂质体可以转变成单层囊泡脂质体。单层囊泡脂质体更利于研究生物膜上的转运以及膜融合。制作单层囊泡质体的有两种方法：一种是挤压脂质通过具有均一孔径的聚碳酸酯膜，这样可以产生大单层囊泡脂（LUVs）--大单层脂质体。大脂质体的大小取决于聚碳酸酯膜的孔径大小。然而，膜孔径大于200nm所获得的脂质体都不止一层脂。直径低于50nm的脂质体很难通过这样的方法获得。第二种方法则是超声法，这种方法可以产生小单层囊泡脂（SUVs）--小单层脂质体。脂质体的直径可以小到20nm。小单层脂质体拥有比大单层脂质体个高的曲率，这仅仅是由于脂质的形态学特征造成的。

1.2立方相（cubic phase）

立方相这个术语在晶体学里面是指单个晶胞在排列上的一种对称元素。有许多类型的立方相，一般可分为两类：反向微球立方相和双连续立方相。在反向微球立方相中的脂质聚集成球，每个球代表一个单胞，在整个结构中与其他的球紧紧堆在一起。反向微球之所以称之为“反向”是因为脂质的的极性头部向内指向微球的中心，微球的表面是非极性的。也正因如此，反向微球脂质与正向微球脂质在水中更易有序的聚集成立方相。

另外一种立方相是双连续立方相。双连续是指在空间内的脂质相和水通道都是连续的。（例如，物质可以沿着水通道从结构中的一个位置移动到结构中的另外一个位置而不需要跨过脂质的屏障，类似的，物质也可以沿着脂质移动大范围的距离而不需要经过水相）。这种双连续的排列方式可以产生许多不同的形态，所有的这些形态都是立方对称但属于不同的空间群（例如，它们拥有不同的对称元素）。在脂质立方相中，主要有三种常见的不同空间群的双连续脂质立方相：G(gyroid)Ia3d、P(primitive)Im3m、D(diamond)Pn3m。

1.3六角相（hexagonal phase）

在六角相里面，脂质堆积在一起形成中空的缸体形状。在水中最常见的六角相要数反向六角相，因为它属于II型脂质相，可以写作HⅡ.在该相中脂质烃链的甲基末端形成了缸体的外表面，极性头部面对着充满水的缸体中心。这些脂质缸体以六角对称堆积在一起，每个脂质缸体周围被其他六个缸体有序包围。因此，我们把这种脂质相叫做六角相。作为一种II型反相脂质相，反向六角相包含一捆中空脂质缸体，它们外部疏水并与水接触。除此之外，六角对称的直的缸体末端烃链将会完全暴露于水中。然而，HⅡ在过量的水中也很稳定，这是为什么呢？主要有三个原因可以做出解释。一，脂质缸体可能不是直的而是有足够的弯曲使得缸体形成环形结构，这样就可以避免暴露平末端。从这种结构的电子显微镜下的观察找到了部分证据。第二个原因是脂质缸体大量的聚集使得表面积与体积之比很小，转而稳定了改结构。最后，可能在脂质缸体周围有一层暴露极性头部的脂单分子层，但是目前还没有任何证据。

尽管脂质双分子层是在生物系统中最常见的脂质相，但是许多从生物膜上提纯的脂质在室温和过量的水的条件下会形成非层状相。决定脂质相的因素很多，在这里我就不赘述了。

脂质立方相的历史与未来（The history and future of LCP）64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 两性分子在水中可以形成很多形态各异的结构，这个理论早在1960年的时候就被证明和建立，与此同时，luzzati V.等人首次发现了脂质液晶相(Luzzati, Mustacchi, Skoulios, and Huon, 1960）。1962年luzzati的研究组测定了层状相的结构，也知道六角相的电子显微结构，随后不久用X射线技术测定了类脂立方相的结构（VITTORIO LUZZATI, A.TARDIEU, T.GULIK-KRZYWICKI, E.RIVAS & F.REISS-HUSSON,nature1962），到1968年luzzati与加拿大的研究专家对脂质-水体系（lipid-water system）进行了X射线的研究，得到了脂质-水体系的随脂质浓度和温度变化的部分相图（R.P.Rand and V.Luzzati,1968).1980年laron提出立方液晶中无限循环排列的脂双层膜非常类似于生物膜中的脂双层膜。1990年Engbrom S.及其同事根据脂质立方液晶的结构特点，提出可以将类脂立方液晶用作药物载体。脂质立方相应用于膜蛋白结晶最早是在1996年，Landau & Rosenbusch通过脂质立方相获得了第一个完整的细菌视紫红质蛋白的3.7埃的晶体结构。（在此，我想提一下，1988年获得诺贝尔化学奖的哈特穆特·米歇尔Hartmut Michel早在1977博士毕业后就认为细菌视紫红质可以结晶，1979年发现了第一个细菌视紫红质蛋白的晶体，但是晶体太小太混乱，所以一直想得到高质量的晶体却始终没有获得，最后他和他的研究团队沃尔夫拉姆·伯德，乔安(汉斯)·戴森霍费尔Johann Deisenhofer在1985年获得光合反应中心的另外一个蛋白的晶体，也是世界上第一个膜蛋白晶体，并凭此获得了1988年诺贝尔化学奖）在此之后，通过脂质立方相结晶膜蛋白就成为一个很实用的技术被广泛传播。

时间证明这项技术对于阐明膜蛋白的结构机制是至关重要的，近年来，通过LCP获得了很多关键蛋白的结构信息，譬如，各种细菌视紫红质蛋白以及第一个高分辨率的人源G蛋白偶联受体（β2-adrenergic receptor）。运用脂质立方相获得高分辨率的膜蛋白晶体的成功主要归咎于以下两个原因：与使用去垢剂与蛋白形成微球的恶劣环境不同，脂质立方相提供了一个更加接近天然的类似生物膜的环境。另外，在脂质立方相中，晶体生长时蛋白分子是按照I型堆积方式堆积，也就是蛋白分子不仅通过亲水部位相互作用堆积，也通过疏水部位相互接触而堆积，从而使得晶体结构更加有序，所含的水更少。到目前为止，通过LCP获得的晶体结构达82个，蛋白种类达18种，晶型27种（LCP sources from the cherezov lab）。目前，scripps研究院还开发了一种LCP-FRAP预结晶实验技术，它运用蛋白荧光标记技术，检测膜蛋白在油脂相中的荧光漂白恢复率及扩散系数，以此来筛选有前景的蛋白construct，主要的脂质和脂质添加剂，以及限定可能的沉淀剂和缓冲液的范围。这种方法可以实现高通量膜蛋白结晶筛选，减少蛋白质和脂质的消耗。因此，我们可以看出LCP为结构生物学研究提供了一个强有力的工具，在未来膜蛋白结构生物学研究中将扮演着举足轻重的角色。

脂质立方相结晶膜蛋白：操作步骤（crystallizing membrane proteins in mesophases：protocol）1.脂质的制备

LCP结晶实验的经验告诉我们，我们所用的脂一般为monolein（1-oleoyl-rac-glycerol油酸单甘油酯），这个称之为主要脂质，在必要的时候我们也要筛选一些添加脂质。胆固醇被证明是最好且最有效的脂质添加剂，可以增加晶体的大小或者分辨率。下面是混合脂质制备方法：

材料：monoolein（sigma or Nu-Chek Prep）、additive lipid（sigma or Avanti Polar lipids）Chloroform(HPLC grade, Sigma).步骤：参见http://cherezov.scripps.edu/lipmix.htm 2.LCP蛋白重构 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123

参见http://cherezov.scripps.edu/reconstitution.htm 3.手动结晶实验

参见http://cherezov.scripps.edu/crystallization.htm 4.收获晶体

参见http://cherezov.scripps.edu/harvesting.htm 注意事项（Tips）

1.首先，知道自己到底要的是什么。充分利用脂质结构随温度和脂质浓度变化的相图，在室温下，初始得脂质立方相会在水的比重为40%（w/w）左右产生。

2.在学习改技术初期，建议用水或者调节缓冲液替代你的蛋白样品，以此来熟悉该技术和相关仪器。3.初期的脂质立方相的形成是必然的，但是它很容易被去垢剂，盐，沉淀剂等混合相中的溶剂破坏。所以，要经常检查你用的条件后相的状态。可以用小角度X射线散射（SARX）或者偏振光显微镜（PLM)。

4.大多数使用的脂都很容易被氧化，因此要尽量减少操作时间。另外，像monoolein是很容易吸湿的，所以在用之前一定要先等其温度到室温。

5.优化晶体结晶条件是，可以尝试改变缓冲液，温度，盐浓度，加入添加剂等等。在in meso这个方法里面，我们可以改变脂质的组成成分或者添加脂质，但不要破坏脂质立方相。

6.各种商业筛选条件也可以尝试。

2011年08月27日

于 杭州.浙江