高效第十章甾体激素类药物的分析[推荐]_第十章甾类激素药物

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甾体激素类药物分析

第十章．甾体激素类药物的分析

基本要求：掌握醋酸地塞米松及其制剂、丙酸睾酮、黄体酮、炔雌醇及其制剂的鉴别、杂质检查和含量测定方法。

第一节 基本结构与分类

一、结构特点

天然和人工合成品的甾体激素，均具有环戊烷骈多氢菲母核。

结构特点：A环，多为脂环，且C4/C5间有双键，并与C3酮基共轭，称为α，β-不饱和酮，标记为Δ4-3-酮；少数为苯环；C3，可能有酮基或羟基；C10、C13，多数为角甲基，少数C10无角甲基；C11，可能有酮基或羟基；C17，可能有羟基、酮基、甲酮基、α-醇酮基、甲基、乙炔基等；人工合成的甾体激素，有些在C6或C9上引入卤素，C16上引入甲基、羟基，以及具有C1/C2双键等；有些取代基是α型（用虚线表示），有些是β型（用实线表示）。

二、分类

肾上腺皮质激素和性激素两大类。性激素又分雄性激素及蛋白同化激素、孕激素、雌激素等。

(二)肾上腺皮质激素

天然和合成的肾上腺皮质激素（皮质激素）均可视为皮质酮的衍生物。C21-羟基所形成的酯类（醋酸、磷酸、戊酸、己酸等的酯），肌注有长效作用。成钠盐水溶性增加，如氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠等。

结构特点：有21个C原子；A环，具有Δ4-3-酮； C17，有α-醇酮基，并多数为α-羟基；C10、C13，有角甲基；C11，有羟基或酮基；其它，有些皮质激素具有Δ1，6α、9α卤素，16α羟基，6α、12α、16α、16β甲基等。

（二）雄性激素及蛋白同化激素

临床常用睾酮的衍生物，如甲睾酮、丙酸睾酮、十一酸睾酮等；蛋白同化激素有苯丙酸诺龙。

结构特点：雄性激素母核具有19个C原子；蛋白同化激素母核具有18个C原子（C10上无角甲基）；A环，具有Δ4-3-酮；C17，无侧链，多数是一个β-羟基，有些是它形成的酯，有些具有α-甲基。

（三）孕激素

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甾体激素类药物分析 1.C17-α-醇酮基 有还原性，能与氧化剂四氮唑盐反应显色。（可做薄层的显色剂）；

2.酮基 C3-、C20-能与2，4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼等羰基试剂反应呈色。

3.甲酮基以及活泼亚甲基 能与亚硝铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛类反应呈色。

4.有机氟 经氧瓶燃烧后生成无机氟化物，在与茜素蓝及硝酸亚铈呈色； 5.酚羟基 能与重氮磺酸反应生成红色偶氮染料。

二、沉淀反应

1.与斐林试剂 C17-α-醇酮基具有还原性，生成橙红色氧化亚铜沉淀。2.氨基硝酸银 C17-α-醇酮基，黑色金属银沉淀 3.硝酸银 炔雌醇、炔诺酮，白色沉淀。

4.硝酸-硝酸银 有机氯破坏在酸性条件下，白色沉淀。

三、制备衍生物测定其熔点

生成酯、肟、缩氨基脲，或利用醇制碱液水解甾体酯类生成相应的母体，然后测定其熔点。

1.酯的生成 2.酮肟的生成 3.缩氨基脲的生成 4.酯的水解

四、水解产物的反应

醋酸、戊酸和己酸酯水解后鉴别酸。

五、紫外分光光度法

C=C-C=O和C=C-C=C共轭系统，可用规定波长和吸收度比值法鉴别。

六、红外分光光度法

结构复杂，各国药典几乎均采用红外分光光度法鉴别，中国药典95版。36种原料，其中33种采用该法。

七、薄层色谱法

简便、快速、分离效能高等特点。

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甾体激素类药物分析 精密量取甲醇10μl（相当于7.9mg）与丙酮100μl（相当于79mg），置100ml量瓶中，精密加0.1%（ml/ml）正丙醇（内标物质）溶液20ml，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照液；另取本品月约0.16g，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入上述内标溶液2ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品。取上述溶液，照气相色谱法，用高分子多孔小球色谱柱（按正丙醇计算的理论板数应大于700），在柱温150℃测定。含丙酮不得过5.0%（g/g），并不得出现甲醇峰。

本品在生产工艺中使用大量甲醇和丙酮，因此要检查。甲醇的检测限为3.1ng。

三、雌酮

炔雌酮中雌酮检查方法如下：

取本品5mg溶于0.5ml乙醇，加间二硝基苯0.05g，再加新配制的稀氢氧化钾-乙醇液0.5ml，在暗处放置1h后，再加乙醇10ml 时，溶液呈现的颜色不得比下面的对照液更深。对照液：不加本品同样方法制成。

原理：Zimmermann反应，羰基的邻位具有活泼亚甲基的化合物，在碱性的氢氧化钾乙醇溶液中，与间二硝基苯反应呈红~蓝色。雌酮是17-酮甾类，因此根据该反应生成紫红色化合物，必须使用高纯度的间二硝基苯，否则呈褐色而难于判定。

四、硒

五、其他甾体

甾体激素药物多由甾体母体或结构类似的其他甾体激素制备而来，也具有一定的药理作用而又互相不相同，使其他甾体或有关物质的限度检查显得非常必要，成为甾体激素药物纯度检查的一个重要项目。TLC和HPLC为各国近版药典采用36中原料中34中采用薄层色谱法检查；10中原料已采用HPLC法。

薄层色谱法药典色谱条件：

1.薄层板：大多采用硅胶G板，少数采用硅胶GF254或硅胶HF254。2.供试液和对照液的制备：取一定量供试品和对照品，分别用溶剂（如氯仿-甲醇或甲醇或氯仿或丙酮）配成一定浓度的溶液。

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甾体激素类药物分析 容量法、比色法、紫外分光光度法、荧光法、气相色谱法、高效液相色谱法等，本章重点讨论四氮唑比色法、异烟肼比色法、Kober反应比色法、紫外分光光度法、高效液相色谱法等。

一、四氮唑比色法

（一）四氮唑的种类 两种：2，3，5-三苯基氯化四氮唑（缩写为TTC），其还原产物为不溶于水的深红色三苯甲簪，λmax在480~490nm，也称红四氮唑（缩写为RT）。蓝四氮唑（缩写BT），其还原产物为暗蓝色的双甲簪，λmax在525nm左右。TTC和BT的结构式如下：

（二）反应原理

皮质激素C17-α-醇酮基具有还原性，在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原为有色甲簪。

可能路线为α-醇酮基，失去2个电子氧化为20-酮基-21醛基，在碱催化下，分子内部重排；有部分形成20-羟基-21-醛基，C20-C21键断裂形成甾基甲酸衍生物和甲醛，以前者为主。四氮唑盐得到2个电子，开环形成甲簪显色。

（三）测定方法 USP（23）采用蓝四氮唑；中国药典（1995版）和BP（1993）采用红四氮唑。

中国药典收载地醋酸泼尼松龙软膏的含量测定方法如下：

1.对照品溶液制备：精密称取醋酸泼尼松龙对照品20mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.供试品溶液的制备：精密称取本品4g（约相当于醋酸泼尼松龙20mg），置烧杯中，加无水乙醇约30ml，置水浴上加热，充分搅拌，使醋酸泼尼松龙溶解，在置冰浴中放冷后，滤过，滤液滤入100ml量瓶中，同法提取3次，滤液并入量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

3.测定法：精密量取对照品溶液及供试品溶液各1ml，分别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙醇9ml与氯化三苯四氮唑试液2ml，摇匀，再精密加氢氧化四甲基铵试液1ml，摇匀，在25℃暗处放置40~45min，照分光光度法，在485nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。

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解，在置冰浴中放冷后，滤过，滤液滤入100ml量瓶中，同法提取3次，滤液并入量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

3.测定法：精密量取对照品溶液及供试品溶液各10ml，分别置具塞容器中置水浴中蒸去乙醇，残渣中加氯仿10ml，振摇，使残渣溶解，各精密加0.1%异烟肼甲醇溶液（取异烟肼0.5g，加盐酸0.63ml，加甲醇使溶解成500ml，即得）10ml，摇匀，置55℃暗处保温45min，取出放冷至室温，用氯仿稀释至25ml，摇匀，照分光光度法，在415nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。

（三）讨论

1.溶剂选择：无水乙醇和甲醇好，其他受溶解度影响不能采用甲醇稳定性较好，呈色强度较高。

2.酸的种类和浓度以及异烟肼的浓度：酸与异烟肼试剂的摩尔比为2：1时可获得最大吸收度。

3.水分、温度、光线和氧的影响：水增高吸收度降低，缩合水解；温度升高，反应加速。在实验条件下，光与氧不影响反应。

4.反应的专属性：Δ4-3-酮基的甾体激素在室温不到1h即可定量地与酸性异烟肼反应；其他长时间放置或加热后方可反应完全，因此在反应条件下，本法对Δ4-3-酮基甾体具有一定的专属性。

三、KOBER反应比色法

指雌激素与硫酸-乙醇共热呈色，用水或稀硫酸稀释后重新加热发生颜色改变，并在515nm附近有最大吸收。

反应分两步：与硫酸-乙醇共热产生黄色，在465nm处有最大吸收；加水或稀硫酸稀释重新加热显桃红色，在515nm处有最大吸收。

可能原理：通过去羟基、重排及甲基由C13移到C17而形成产物（1）；然后被硫酸氧化形成具有较长共扼双键发色团的产物（3）及进一步生成具有吸收光谱红移发色团的产物（4）。

铁-酚试剂文献上也称铁-柯柏试剂。为硫酸亚铁铵加水溶解后，加硫酸及过氧化氢，再与苯酚混合制成。改进法，优点：铁加速速度和强度，加速黄色转变为红色，也增加稳定性；酚加入，可以消除反应中产生的荧光并加速红色的形成。

炔雌醇片的含量测定方法如下：

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烷键和硅胶；流动相甲醇-水-乙醚、乙腈-水-乙丙醇、甲醇-四氢呋喃-水、甲醇-乙腈-水等的混合液。为了提高分离效率、获得满意的峰形，有时在流动相中加入醋酸缓冲液或磷酸缓冲液调节流动相的pH值，紫外直接检测。

醋酸泼尼松龙的测定方法如下：

1.色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键和硅胶为填充柱，甲醇-水（70：30）为流动相，检测波长为240nm。理论塔板数按醋酸泼尼松龙计算应不低于3000，醋酸泼尼松龙和内标物质峰的分离度应符合要求。

2.内标溶液的制备 取醋酸氟氢松，加甲醇制成每1ml中含0.50mg的溶液，即得。

3.测定法 取醋酸泼尼松龙对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.50mg的溶液；精密量取该溶液与内标溶液各5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取本品适量，同法测定，按内标法以峰面积计算，即得。

甾体激素类药物的分析小结

一、基本结构结构特点

1．基本结构

C21C20CABD 1．典型药物的结构 甾体激素类药物主要包括： 肾上腺皮质激素

性激素：雄性激素及蛋白同化激素、孕激素、雌激素

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间二硝基酚、芳香醛类

C3-酚羟基 重氮苯磺酸 雌激素

炔基 硝酸银 炔磁醇、炔诺酮、炔诺孕酮

有机氟 氧瓶燃烧后与茜素氟蓝、醋酸氟轻松、醋酸地塞米松

硝酸亚铈反应

有机氯 结合在链烃上，加热水 丙酸氯倍他索

解，结合在母核的环上，丙酸倍氯米松 氧瓶燃烧，硝酸-硝酸银

C17、C21位上羟基的酯 水解后产生羧酸：醋酸 醋酸地塞米松

与乙醇形成乙酸乙酯； 戊酸雌二醇 戊酸与己酸具特殊臭味 己酸羟孕酮

（二）制备衍生物测定其熔点

反应名称 药物 试剂 衍生物 缩氨基脲的生成 苯丙酸诺龙 盐酸氨基脲 缩氨基脲衍生物 酯的水解 丙酸睾酮 醇制氢氧化钾 睾酮

（三）紫外分光光度法

结构依据：Δ4-3-酮、苯环、其他共轭结构 示例：

药物名称 溶剂 浓度 结果判断

曲安西龙 甲醇 20μg/ml 在238nm处有最大吸收

丙酸倍氯米松 乙醇 20μg/ml 在239nm处有最大吸收，A为0.57～

0.60，在239nm与263nm处的吸收度比值为2.25～2.45

（四）红外分光光度法

炔磁醇 峰位（cm-1）归属 官能团 3300～3600 υ1616，1590，1505 υ

O-H

酚羟基、C17-羟基

苯环

C=C

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甾体激素类药物分析 示例：炔孕酮的含量测定 醋酸地塞米松片的含量测定：

标示量百分含量 =A×100×W×1031%E1cm×20×W×标示量×100%

(三)比色法 1.异烟肼比色法：

（1）基本原理：C3-酮基及某些其他位置上的酮基都能在酸性条件下与羰基试剂异烟肼缩合，形成黄色的异烟腙，在一定波长下具有最大吸收。（2）讨论

溶剂：无水乙醇、无水甲醇

酸的种类和浓度以及异烟肼的浓度： 摩尔比 盐酸: 异烟肼 2:1，盐酸浓度0.0074mol/L 异烟肼浓度0.00365mol/L 水分、温度、光线、氧：吸收度随溶剂中含水量的增高而减低

温度升高，反应加速

在不使溶剂挥发和吸收水分的情况下，光和氧不

影响反应。

2.四氮唑比色法

（1）基本原理：C17-α-醇-酮基具有还原性，在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原为有色formazan，在一定波长处进行比色测定。（2）四氮唑盐：红四氮唑（2，3，5-三苯基氯化四氮唑）

蓝四氮唑（3，3‘-二甲氧苯基-双-4，4‘-（3，5-二苯基）氯 化四氮唑）

（3）影响因素：基团影响

溶剂和水分影响

碱的种类和加入顺序的影响 空气中氧及光线的影响 温度与时间的影响

3.Kober反应比色法

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二、答案精讲 [A型题]

1.D 醋酸地塞米松的分子结构中含有α-醇酮基, 可与碱性酒石酸铜试液反应,可用此反应进行鉴别。故选D。

2．C 丙酸睾酮《中国药典》规定的含量测定方法为HPLC法。故选C。[B型题] 1.A 2.E 3.C 4.D [X型题] 1.A B C E 因甾体激素类药物的含量测定多采用HPLC法，故选A，B，C，E。2.A B E