氯仿法提取DNA_氯仿法提取dna
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试验原理：
苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。试验步骤：
1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。
2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。
3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿﹕异戊醇（24﹕1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。
4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。
组成浓度：10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0 配制量：500ml 配制方法：量取下列溶液于500ml烧杯中 1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml 0.5M EDTA PH=8.0 1ml 向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.称82克乙酸钠溶于适量水中，加入60克冰乙酸，然后转移到1000毫升的容量瓶中，用少量水洗涤烧杯2到3次，洗液并入容量瓶中，再定容到刻度线即可。
磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer, PB）
试剂： NaH2PO4•2H2O
Na2HPO4•12H2O
配制方法：配制时，常先配制0.2mol/L的 NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PB），根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。（1）0.2mol/L的 NaH2PO4；称取NaH2PO4.2H2O 31.2g(或 NaH2PO4•H2O 27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。
（2）0.2mol/L的Na2HPO4：称取Na2HPO4.12H2O 71.632g（或 Na2HPO4•7H2O 53.6g或 Na2HPO4•2H2O 35.6g）加重蒸水至1000ml溶解。
（3）0.2mol/L pH7.4的PB的配制：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4和81ml 0.2mol/L的 Na2HPO4•12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PB（pH约为7.4～7.5）。若pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可。0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.7～8.0）
pH 0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2HPO4(ml)5.7
93.5
6.5 5.8
92.0
8.0 5.9
90.0
10.0 6.0
87.7
12.3 6.1
85.0
15.0 6.2
81.5
18.5 6.3
77.5
22.5 6.4
73.5
26.5 6.5
68.5
31.5 6.6
62.5
37.5 6.7
56.5
43.5 6.8
51.0
49.0 6.9
45.0
55.0 7.0
39.0
61.0 7.1
33.0
67.0 7.2
28.0
72.0 7.3
23.0
67.0 7.4
19.0
81.0 7.5
16.0
84.0 7.6
13.0
87.0 7.7
10.5
89.5 7.8
8.5
91.5 7.9
7.0
93.0 8.0
5.3
94.7
