microRNA反转和定量引物设计(看完就会设计自己的引物)_microrna引物设计

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以hsa-miR-145为例设计引物，其成熟体序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU

一 设计引物反转录之后扩增所需引物设计

反向引物（反转之后跑PCR所需的引物）：每个反向引物的都带有一段固定的序列，可以形成一个茎环，固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是hsa-miR-145从后面数八个碱基的反向互补序列，就是GAAUCCCU的反向互补：AGGGATTC，最后得到的反向引物的序列为

5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGGGATTC-3，2定量引物设计

正向引物：每个正向引物也带有一段固定的序列，固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG

在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列，成熟体除掉后面六个碱基后序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGA，把U变成T即可，最后的序列为：

5，-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3，URP(unified reverse primer)：统一反向引物，也是一段固定的序列，TGGTGTCGTGGAGTCG

U6引物

上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA

下游引物AACGCTTCACGAATTTGCGT

二 使用方法：

1反转录之后跑PCR的引物：所有要做的miRNA反向引物的混合，每个10微升RT-PCR的引物：50微升的体系，30微升的水，10微升的正向引物，10微升的URP（内参50微升的体系，30微升的水，10微升U6的正向引物，10微升U6的下游引物）