济南市艾滋病检测新技术与生物安全管理培训报告_生物安全管理培训

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济南市艾滋病检测新技术与生物安全管理培训报告

10月26日，2012年度全市艾滋病检测技术与生物安全管理培训班在市疾控中心举办。培训班邀请国家疾控中心艾滋病参比实验室邢*教授就“艾滋病检测技术进展及质量控制”进行了授课；市疾控中心韩秀云、潘晶讲授了艾滋病筛查实验室职业暴露与生物安全防护等知识。学习内容有以下几点：

1． 酶联免疫反应（ELISA）技术

ELISA基本原理：是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，是标记免疫技术的一种。免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即应用制备好的特异性抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。

特点是具有高度的特异性和敏感性。将抗原或抗体用可以微量检测的标记物(例如放射性核素、荧光素、酶等)进行标记，则在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。

标记免疫技术一般分为两类。一类用于组织切片或其他标本中抗原或抗体的定位属于免疫组化技术。另一类用于液体标本中抗原或抗体的测定。称为免疫检测。

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：① 固相的抗原或抗体，② 酶标记的抗原或抗体，③ 酶作用的底物，根据试剂的来源和标本的性状以及检测的条件，可设计出

各种不同的检测方法。

双抗体夹心法：最常用的方法，操作步骤如下：

(1)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质（在商品化的试剂盒中，已经完成此步骤）。

(2)加受检标本，使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与同相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

(3)加酶标抗体，使固相抗原复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

(4)加底物：酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

双抗原夹心法：

根据双抗体夹心法的原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可双抗原夹心法测定标本中的抗体。（HIV试剂多属于此种类型）

ELISA试剂盒的组成：ELISA的成品试剂盒中包含以下各组分：(1)已包被抗原或抗体的固相载体(96孔板);(2)酶标记的抗原或抗体(结合物)(3)酶的底物（缓冲液和底物液或称A/B液）(4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中)(5)有些试剂盒中还有标本的稀释液

(6)洗涤液（基本为通用的浓缩磷酸盐溶液）(7)酶反应终止液（一般为弱硫酸液）

ELISA试剂盒的选择：必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批批检验合格、在有效期内的试剂。推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。

ELISA方法模式图

ELISA检测需注意的问题：操作环境、环境温度、仪器的校准、洗板机的维护、比色波长的设定、Cutoff值计算。ELISA试验的假阳性反应：

a.溶血样本：溶血标本可能会增加非特异性显色。

b.CMV、EBV、红斑狼疮、风湿病患者：自身抗体与HIV-1的某些抗原决定簇有交叉反应性，在初筛检测时可能导致假阳性现象。c.新生儿:20%～60%的婴儿受到HIV感染,因为母体HIV抗体可持续大约15个月之久, d.技术误差

e.细菌污染：菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。

f.抗凝：抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性.g.辣根过氧化物酶：国产 ELISA试剂一般都用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)制备结合物。HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增 加非特异性显色。

2．HIV的筛查及确证检测 艾滋病筛查实验室的职能：

a.对收到的血液样品进行艾滋病筛查检测，并及时妥善进行原始资料的登记及管理工作。

b.对HIV抗体不确定标本进行追踪。

c.及时通过网络进行“月报告”；济南市要求5日之前上报。e.接受上一级艾滋病实验室的业务考核和现场督导。

d.接受患者关于HIV知识的咨询解释工作。（对HIV检测所涉及内容要贯彻保密原则）HIV筛查实验室检测要求：

a.方法是使用ELISA(第三代/第四代)、化学发光等技术规范准许的检测方法;b.不能只用快速检测作为初筛实验。

c.无论何种实验，必须留有原始检测记录，包括快速检测也必须留存检测记录。

d.对于初筛阳性的样品，需要再进行2次筛查检测，其中至少一次检

测要使用不同厂家或不同方法进行。艾滋病筛查实验室阳性标本的处理: a.对于再次检测后，其中任一种方法呈现阳性反应的标本，应在24小时内上送“艾滋病确证实验室”。

b.将阳性标本装入带螺帽的冻存管中，放入4℃冰箱中暂时储存。

c.填写HIV疑似阳性标本“复检检测单”。

d.检测单中必须填写的项目：基本信息，重点是身份证号的填写；检测数据的S/CO值。

艾滋病筛查阳性标本送样须知:

a.必须使用生物制品转运箱；三层包装上送。

b.必须专人专车运送；不能使用公共交通工具转运阳性反应样品。c.必须填写“复检检测单”及“阳性标本转运登记” d.2013年起将对送样不合格单位进行记录，年底评比计分。艾滋病筛查阳性标本送样须知: 采用ＷＨＯ提出的三级包装系统。

第一层容器：装样品，要求防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。

第二层容器：要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护第一层容器，可装多个第一层容器。将试管装入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒处理。

第三层容器：放在一个运输用外层包装内，应易于消毒。外面要贴标

签（数量，收、发件人）。

第一层容器第二层容器第三层容器

艾滋病筛查实验室的报告格式： a.阴性：HIV抗体阴性“—” b.阳性：HIV-1抗体阳性“+” c.不确定：HIV抗体不确定“±”

d.在收到确证检测报告之前，可先出具“HIV抗体待复查”报告。e.艾滋病确证实验室出具的报告，筛查实验室需留存复印件。HIV确证检测：

WB是首选的用于HIV抗体的确认实验，WB的检测结果常常被作为鉴别其他检验方法优劣的“金标准”。

WB的敏感性一般不低于初筛实验，但它的特异性很高，这主要是基于HIV不同抗原组分的分离以及浓缩和纯化，能够检测针对不同抗原成分的抗体。

WB技术主要包括3个部分：

（1）通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将HIV抗原按照分子量大小而分离。（2）将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上。

（3）加样检测标本中是否含有针对不同抗原组分的抗体。前2步操作由试剂生产厂家完成，检测人员只需进行第3步 3.HIV筛查实验室注意事项

操作程序文件（SOP）、实验室生物安全手册、实验室的档案管理、筛查实验室样品的保存、HIV抗体不确定追踪处理 4.质控品的配制及质控图的绘制 质控品梯度稀释方法：

60/110μl阳性血清60/110μl混合液60/110μl阴性血清60/110μl阴性血清60/110μl阴性血清60/110μl阴性血清60/110μl阴性血清60/110μl阴性血清 将梯度稀释后的样品同普通样品一样进行OD值测定

质控方法的种类：前20次试验得到的质控品值，使用“即刻法”进行质控。

从第21次开始过渡为Levey-Jennings法进行质控。

5.生物安全防护：是指避免生物危险因子，特别是偶然的和有意利用的生物因子，对生物体包括实验室工作者在内的伤害和对环境的污染的意

识和措施。

实验室生物安全防护分为一级防护（屏障）和二级防护（屏障）。

HIV实验室生物安全级别：

艾滋病血清学检测：包括艾滋病筛查和确证实验室、免疫学和核酸检测应在符合Ⅱ级生物安全实验室（BSL-2）要求的实验室中进行。HIV分离、研究：HIV分离、细胞培养及研究工作应在Ⅲ级生物安全实验室（BSL-3）中进行。

生物安全柜分级：I级生物安全柜---保护工作人员和环境

II级生物安全柜---保护工作人员、环境和试样（产品）III级生物安全柜---采用手套箱更严格地保护工作人员、环境和试样（产品）

生物安全管理体系文件：

《生物安全管理手册》《程序文件》《风险评估》《安全手册》《作业指导书》《安全数据单》《安全、技术记录》

个人防护装备：

防护部位 ：眼睛、头面部、呼吸道、躯体、手、足、耳（听力）。装备包括：眼镜（安全镜、护目镜）、口罩、面罩、防毒面具、帽子、防护衣(实验服、隔离衣、连体衣、围裙)、手套、鞋套等。

安全脱卸个人防护装备考虑要点：卸去个人防护装备的地方可在实验室门口或实验室前

厅（BSL-1实验室）或离开主实验室在半污染区或缓冲间内卸下个人防护装备（BSL-2和BSL-3实验室）；另外在主实验室外并等门已经关好后卸下防毒面具（BSL-2和BSL-3实验室）。

卸下个人防护装备的顺序按下面顺序进行：

1）手套； 2）面罩或护目镜； 3）隔离衣；

4）口罩或防毒面具和防护帽； 5）鞋套（可再戴新手套）。

生物安全防护操作要点：严格而又不断更新的培训制度。

全员培训上岗，建立培训与复训制度。所有工作人员，包括临时进修人员，都必须经过培训（包括上岗培训和复训），并要接受实验室管理人员的监督，实验室的上级专家要对工作安全及整个安全工作环境负责，所有工作人员均有责任保证自己和他人的工作安全，同时加强新技术新知识培训。

艾滋病职业暴露的处理：

a.艾滋病职业暴露的概念：艾滋病职业暴露—HIV感染者及病人的血液或体液，（阴道分泌物、羊水）及含有HIV的实验室样本，污染了医务人员破损的皮肤、黏膜或被针刺伤或利器割伤。

b.感染的条件：足量的病毒病毒能够存活有病毒排出有侵入的伤口。c.暴露的途径：

皮肤损伤：针刺损伤、皮肤的切割伤。

粘膜暴露： 粘膜部位如眼、鼻、口腔等接触HIV或含有HIV的血液、羊水等。

d.职业暴露的传染源：HIV感染者或艾滋病人的血液、羊水、含血体液、阴道分泌物。含HIV的实验室样本、生物制品、器官等。e.职业暴露常见人群：

一类危险人群：护理人员、医生（妇产科）、助产士。

二类危险人群：血库或化验室的工作人员、尸检人员。

其余危险人群：清洁被血液和污染的环境者

对被血液和污染的器具祛污、消毒、维护者

处理污染的被服和废弃物者

处理盛有污染利器的容器者

处理和运输生物学标本时

对有潜在污染可能的水管进行维护者

即：凡提供医疗服务的大多部门均有可能发生职业暴露。f.造成职业暴露可能因素： 1.没有安全防护的规章制度

2.没有按照常规进行操作 3.对职业暴露缺乏自我保健意识 4.缺乏职业暴露的专业知识 5.不可避免地处于高度暴露的环境 g.不会发生职业暴露的情况：

1.在不直接接触血液和感染性体液的情况下给HIV感染者或艾滋病人做常规体检；

2.接触到HIV感染者或艾滋病人的尿液或汗液； 3.与HIV感染者或艾滋病人谈话、握手。h.HIV职业暴露的处理原则：

1.现场处理2.报告及保密3.风险评估 4.监测及随访 5.预防用药 现场处理：急救

1）如有伤口，应轻轻挤压，使其尽量挤出血液，用肥皂水或清水冲洗。2）受伤部位的消毒：伤口应用消毒液（如75%酒精，0.2%次氯酸钠，0.2-0.5%过氧乙酸，0.5%碘伏等）浸泡或涂抹消毒，并包扎伤口。3）暴露的粘膜，应用清水或生理盐水冲洗干净。

紧急处理可以减少80%的感染

经过此次培训为加强艾滋病筛查实验室检测技术能力建设、提高实验室人员检测水平和确保实验室检测质量，提供了很好的理论知识，为我们实验室技术人员在以后的工作中提出了新的要求和方向。同时，我也受益匪浅，为今后的工作打下了基石，在以后的工作中必须保持热情、稳重、多思多想。