马铃薯组织培养技术要点（材料）_马铃薯组织培养技术

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马铃薯脱毒种苗组织培养技术要点

班级：园艺112

姓名：马寅

学号：201101070202 摘要：各种病毒、真菌、细菌等对马铃薯的侵染是导致我国马铃薯单产较低的主要原因，马铃薯脱毒种苗有巨大应用前景。本文综合介绍了茎尖培养脱毒法组织培养的各技术要点，收集前沿技术信息。论述了马铃薯脱毒种苗组织培养过程中以及移栽处理。

关键词：马铃薯脱毒种苗 组织培养 移栽

1、马铃薯产业现状及危害其生产的主要因素

栽培种的马铃薯(SolanumtuberosumL．，2n=48)是双子叶种子植物．属茄科(Solanaceae)茄属(Solanum)一年生喜凉草本植物【l】。又名洋芋、土豆，原产南美洲，在我国已有300多年的栽培历史。马铃薯生育期短，产量高，营养丰富，是典型的粮菜两用型作物，是我国四大栽培作物之一。【2】世界马铃薯面积分布的最大特点是以欧、亚两洲种植为主，两者种植面积占世界马铃薯总面积的78％，其中中国、俄罗斯、乌克兰、印度四大生产国占世界种植面积的1／2。而马铃薯的发源地南美洲种植面积只占世界马铃薯总面积的5％。除整个美洲大陆保持相对稳定外，欧洲的种植面积在持续减少，而亚洲、非洲的种植面积在不断增加。马铃薯在生产上绝大多数是利用块茎进行无性繁殖。国际马铃薯中心(CIP)和国际食品政策中心(IFPRI)合作研究表明，到2020年为止，全世界对马铃薯的需求将有望增长40％。超过水稻、小麦和玉米的增长。特别是亚洲和非洲对马铃薯的需求将增长更快。[1]

2、马铃薯组织培养的理论体系及研究现状

2.1组织培养及马铃薯组织培养的发展史

19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活；1902年，德国植物学家哈伯兰特细胞全能性的理论是植物组培的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。植物组培的简单过程如下：剪接植物器官或组织——经过脱分化（也叫去分化）形成愈伤组织——再经过再分化形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。

1955年法国人莫勒尔和他的同事们以马铃薯茎尖为外植体成功地产生无病毒植株，以马铃薯茎尖为外植体成功地产生无病毒植株，20世纪60年代以后由于组织培养技术日趋成熟和完善，世界各地的植物组织培养研究和产业化应用进入迅速发展阶段，几乎所有的马铃薯生产国都使用这项技术进行脱毒快繁，并部分地进行育种研究。2.2脱毒种苗

马铃薯系无性繁殖作物，在生长期间容易受病毒侵染造成退化。一旦感染病毒，无有效药治，病毒在薯块内的积累是导致马铃薯品质、产量下降的主要原因。为了解决这一问题，我国于 20世纪 70 年代初引进了马铃薯茎尖脱毒技术，1976年于内蒙古建立了第 1 个马铃薯脱毒原种场，80 年代逐渐普及到各省、市、自治区。

目前，马铃薯脱病毒的方法主要有 5 种: 茎尖培养脱毒法、热处理脱毒法、热处理结合茎尖培养脱毒法、化学处理脱毒法、愈伤组织培养脱毒法，其中应用最广泛的是茎尖培养脱毒法及其与热处理法相结合的方法。脱毒种苗可以显著减少马铃薯生长期间的病虫害，进而提高马铃薯产量和品质。[4]相关实验及研究已表明，马铃薯脱毒试管苗生长较其他植物组培容易，是组织培养中的模式植物。2.3微型种薯

马铃薯试管薯是指在培养瓶内通过诱导，于试管苗叶腋间形成的直径为2 ～ 10 mm 大小的块茎。微型薯良种繁育体系减少了种薯繁殖周期和有关环节，能够有效保证质量，提高生产水平，加快推广，减少用种量。目前，美国、荷兰等许多国家都在应用微型种薯繁育体系，有的国家已实行了法制化的良种繁育制度。我国在微型种薯方面的研究也取得了一定进展，毛碧增等成功建立了东农303 的高效脱毒微型薯诱导及繁育体系；刘华等用B9结合光照处理诱导试管薯，结果发现所有的黑暗处理都比光周期处理的结薯率高。[3]将脱毒苗定植在网棚，或原原种大田，生产原原种，或定植在温室或网室内诱导脱毒微型薯形成。目前微型薯生产主要采取两种方式：一是试管诱导培养生产微型薯；二是培养试管苗，2 然后通过扦插繁殖，并移栽于无土介质中生产微型薯。[4] 2.4茎尖培养脱毒法及其与热处理法

马铃薯在栽培过程中，植株逐年变小．叶片皱缩卷曲，叶色浓淡不均，茎杆矮小细弱，块茎变形龟裂，产量逐年下降，这些都表明马铃薯已经发生退化。种薯退化是弓1起产量降低和商品性状变差的主要原因聊。据此，科学家从植物生理学、生物化学、栽培技术、栽培环境、种薯贮藏条件、病虫害侵染等方面对马铃薯“退化”进行了深入的研究。研究表明：各种病毒、真菌、细菌等对马铃薯的侵染是导致我国马铃薯单产较低的主要原因。

目前，已知的马铃薯侵染病毒约有30种，由于马铃薯育种体系尚不健全，农民自留种现象普遍致使病毒感染面积占到栽培总面积的80％以上。在我国广大马铃薯产区，危害马铃薯的5种主要病毒为马铃薯x病毒(PVX)、马铃薯A病毒和Y病毒(PVA，PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLILV)，以及马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVD)。其中PVY、PLRV是危害最为严重的2类病毒。[5]

3、马铃薯茎尖脱毒技术的操作规程

3.1材料的选择

实践证明，同一个品种个体之间在产量上或病毒感染程度上都有很大的差异。进行茎尖分生组织培养之前．应于生育期对准备进行脱毒复壮的马铃薯品种或材料，进行田间株选和薯块选择，选择具有该品种典型特性、生长健壮的单株(或无性系)，结合产量情况，选择高产、大薯率高、无病斑的单株作为茎尖脱毒的基础材料，以提高脱毒效果。由于马铃薯纺锤块茎类病毒病(PSTV)在目前用植物茎尖分生组织方法很难脱掉，在进行茎尖剥离脱毒前，应先对人选的块茎进行PSTV检测，淘汰带有PSTV的薯块。[5][6] 3.2材料处理

为提高脱毒效果，脱毒材料在进行茎尖组织剥取前，应进行材料的热处理，以钝化病毒的活性，消除马铃薯卷叶病毒，提高脱毒效果。把入选的马铃薯块茎进行打破休眠和催芽处理，当薯块顶芽生长至lcm后，转入光照培养箱内，以每天12h光照，照度3()()()lx，37℃的高温处理6—8周。3.3取材和消毒

剪取经过热处理后发芽块茎上2～3cm长的芽若干个．用软毛刷轻轻逐个刷洗后放于烧杯中，用纱布封口。放于自来水下冲洗30min，然后在超净工作台进行严格消毒：先用75％的酒精浸15s，无菌水冲洗2次；再用0．1％的升汞浸泡8-10min(或用5％次氯酸钠浸泡5—20min)，无菌水冲洗5～8次，每次3～5min(用无菌水冲洗过程中要不断的晃动放置材料的容器，以保证漂洗更彻底)，冲洗完后放在灭过菌的培养瓶内待用。3.4剥离茎尖和接种

在超净T作台上，将消毒过的芽置于40x的解剖镜下，一手用一把眼科镊子将芽按住．一手用灭过菌的解剖针将叶片一层一层仔细剥掉，直至露出圆亮的生长点，用锋利的无菌解剖针小心切取0．3mm以下的带l，2个叶原基的茎尖．随即将茎尖接种于已准备好的马铃薯茎尖培养基上，以切面接触琼脂。要注意确保所切下的茎尖不能与已剥去部分、解剖镜台或持芽的镊子接触。另外，在剥离过程中，必须注意使茎尖暴露的时间越短越好，因为超净台的气流和酒精灯发出的热都会使茎尖迅速变干。所以在选择解剖镜的灯源时，尽量以冷光灯为好．同时在材料下垫一张灭过菌的湿滤纸保湿，每剥一个茎尖后．换一张无菌湿滤纸。由于块摹萌发的芽的数量有限。加上剥离过程中难免损伤到茎尖，导致可剥离的茎尖最少、成苗的机率小．易造成优良品种和材料的丢失。[7] 经过多年的实践，我们总结出一种行之有效的方法：取经严格消毒过的块茎芽(1cm长)接种在不含任何激素的马铃薯快繁培养基上，于25cc每天光照12h的培养室培养，3～4周后．待芽长成含4、5片叶子的小苗时，剪切成单节段，转接于同样的无激素MS培养基上，培养成苗。同样方法扩繁l-2个周期，等苗达一定数量后，再直接用这些苗来剥离茎尖，既能保证材料不丢失，又能增加茎尖的数量，从而能增加成活的机率。

4、茎尖培养与病毒检测

4.1培养基

选择合适的培养基是茎尖培养成功与否的关键，根据我们的经验，以Ms+GA2mg/L+BA0．5mg/L+NAA0．05+肌醇100mg/L+D-泛酸钙0．2mg/L+食用白糖3％+琼脂0．6％，pH5．8，为比较好的培养基组合。4.2培养

茎尖培养对培养器皿无特殊要求，一般以150ml三角瓶或250ml罐头瓶，每瓶装40ml培养基，为节约培养基，每瓶接种2—3个茎尖，均匀分布于培养基表面。接种好的茎尖放在培养室内培养，温度18-25℃，光照2 000～3 000lx，每天光照12h。培养2周后，培养瓶内的茎尖生长点便明显变大变绿，30—40d即看到明显伸长的小茎，叶原基形成可见的小叶，这时可转入无激素的Ms培养基中。小苗继续生长，并形成根系，4～5个月后即可发育成3—4个叶片的小植株，将其按单节切段，进行扩繁，成苗后，用于病毒检测。

采用离体培养方法，研究了不同浓度多效处理对马铃薯试管苗生长和块茎形成的影响。结果表明，在试管薯诱导条件下，0．1 mg／L多效唑处理促进了‘夏波蒂’提早结薯，使单瓶试管薯鲜重、平均直径和单薯鲜重都显著增加，同时降低了畸形薯率；而单瓶试管薯的结薯数量低于BA+CCC处理，但接近对照。这些结果表明：与广泛应用的矮壮素相比，在马铃薯试管薯生产中使用多效唑能提高试管薯产量和质量，且其使用浓度仅为矮壮素的1／5000，有利于降低残留并节约成本，是矮壮素较好的替代物之一。[6] 适宜的环境条件同样重要。培养室必须清洁、无菌。马铃薯脱毒试管苗在2 000 LX的光照下，每天照16 h。试管苗生长最适宜的温度是白天25-27℃，夜间16-2O℃，一定的昼夜温差有利于试管苗壮苗，培养室的相对湿度为7O-8O，湿度过高过低都不利于试管苗的健壮生长。在阴雨的夏天，要除湿，使湿度降到5O 下，防止真菌，细菌污染。4.3病毒检测

由茎尖分生组织培养获得的小苗，经第一次扩繁后要对其进行严格的病毒检测，以确定材料的脱毒情况。一般采用指示植物鉴定法、电镜检测法或抗血清鉴定法，经病毒检测后，确认是不带病毒的株系，才能进一步利用，对继续带病毒的株系应淘汰或进行再次脱毒。

5、主要存在问题

目前这种离体无性繁殖方法也还存在一些问题，严重制约着马铃薯脱毒推广技术的进一步扩大遗传上的不稳定性。

例如：组织培养条件再生植株器官形成时，可能有许多愈伤组织参与，而这些细胞的遗传成分有的是变异的，有的是小变异的。而通过一个植物器管或一个节段直接长出芽用在具有遗传嵌合性的品种上时，会产生一个严重的问题：不定芽的形成会招致嵌合体裂解出现纯型植株风险。5.1真菌和细菌污染

真菌和细菌污染是马铃薯组培过程中普偏存在地问题，控制不好很容易发生毁灭性的灾难．必须做到提旱预防及时控制。操作前接种室要定期用甲醛熏蒸或紫外线杀菌，工作人员人内必须穿清洁工作服并套鞋套．严格做好工作人员操作前消毒规程．工作人员操作时候必须带口罩禁止说话．严禁非工作人员出入．培养室内的材料，应该坚持定时查询，发现污染问题及时处理同时适当降低培养室的湿度、温度．减少空气当中细菌数量。5.2“玻璃化”现象

不断进行重复离体繁殖的时候．一部分培养物常常变成水渍状、其植株茎部趋于透明状．这类试管苗的生长和繁殖速度都会下降，最后甚至死亡．称之为“玻璃化”现象，玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化引起的。试管苗及时进行继代培养，因为长时间培养，不能及时转移，容易出现玻璃化苗。培养基细胞分裂素与生长素比例控制在一定浓度水平。因为过高。[7]易导致玻璃化苗的产生。培养基中琼脂浓度应该控制在一定水平，过低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重，同时随着多代培养后变异率越来越高．此外控制一定温度、光照、通风都很重要。5.3快繁消毒问题

脱毒苗在快速繁殖的过程中温室或者网室内棚脱毒苗在快速繁殖的过程中温室或者网室内棚顶、墙壁、地面、土壤、蛭石、沙子以及工作人员严格消毒还不够重视，在实际操作中，门窗和通风口50～60目纱布隔离，防止虫媒再次感染。

6、马铃薯脱毒试管苗移栽与成活

从温室建设，壮苗培育，试管苗移栽，水分管理，病虫害防治等方面可提高其移栽成活率。

6.1移栽的条件① 温室内最低温度不低于6度。② 温室内日照时间不低于12 h。③ 无污染的健壮试管苗。④ 温室无虫，无杂菌，基质浇透水。⑤ 基质pH5.5-6.5。6.2移栽

移栽前，在蛭石中撒入1-3 g／m 60 的多菌灵，2-3 g／m 65 代森锰锌；同时，施入2Og／m。的磷酸二铵，10 g／m。的尿素，30 g／m 的硫酸钾，浇透水，盖上无机膜，全温室喷一遍4O% 的氧化乐果800倍液或50 %抗蚜威800-1 000倍液，关闭门窗，提高基质温度。5-7 d后，揭开无机膜，换气，2-3 d后待用。

(2)移栽时，选择苗高6-8 cm健壮且根系发达的试管苗，打开培养瓶口，置于炼苗室内2-3d。取出试管苗，在6℃中的水中将培养基冲洗干净，浸入强力生根灵6 00O-8 000倍液2-3 min或25 mg/L的ABT生根剂溶液10-15 rain，然后，捞出来，按照4 cm×6 cm进行定植。定植时，用手指将蛭石划开2-3 cm深的沟，把苗根放直，撒1-2 cm厚的蛭石，用雾状喷头喷水或喷雾器喷水，覆盖塑料膜及60-70％ 的遮阳网。保持空气湿度及防止强光直射，散射光有利于缓苗。

7、马铃薯组织培养的前景展望

组织培养是一种打破传统的新型繁衍后代方法，能最大效率地利用空间，使高等作物生 长发育的微生物化，田间马铃薯育种材料圃种植 45000株/hm2在组织培养室每4cm ²培养1株且能多层架放置培养瓶加上繁殖周期短 变异母体材料扩大了500-2000倍。同时由于组织培养条件使染色体突变率的增强若再增设人工诱导突变剂，提高了变异率，所以组织培养在马铃薯育种是一种很有潜力的方法。[9]

参考文献：

[1]屈冬玉，谢开云，金黎平，等．中国马铃薯产业现状与趋势

[2]中国马铃薯学术研讨会与第五届马铃薯大会论文集．2004：230—239． 裴荣信．马铃薯小整薯播种的理论与实践．马铃薯杂志

[3]司怀辉等我国马铃薯组织和细胞培养研究进展，中国马铃薯。

[5]胡赞民;邓向东;陈正华马铃薯脱毒微型薯人工种子工厂化生产技术研究[期刊论文]-中国科学院院刊。

[6]多效唑对马铃薯试管苗生长和块茎形成的影响张志军1，李会珍 2，姚宏亮2，周伟军2(1．浙江大学农学系，浙江杭州310029；2．山西省农业种子总站，山西太原030001)[7]提高马铃薯脱毒试管苗温室移栽成活率的方法孙伟势(陕西省商洛市农业科学研究所，陕西商洛726000 [8]昆明市马铃薯茎尖分生组织培养脱毒技术 昆明市农科院 张丽芳等

[9]马铃薯茎尖脱毒号I央繁技术应用研究进展张思鸣1，王勇2，胡钧铭2，王传之2(1．贵港市种子管理站，广西贵港537100；2．广西大学农学院，广西南宁530005)