实验二 外植体灭菌及其初代培养物的建立 副本_灭菌培养试验

实验二 外植体灭菌及其初代培养物的建立 副本由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“灭菌培养试验”。

实验二 外植体灭菌及其初代培养物的建立

一、实验目的通过外植体的灭菌处理、超净工作台上外植体接种等无菌操作训练，掌握植物组织培养材料灭菌的基本方法及无菌操作技术，建立初代无菌培养体系。

一、实验原理

从田间或温室中选取的外植体，都不同程度地带有各种程度的微生物。这些微生物一旦带入培养基，便会迅速生长，造成培养基和培养材料的污染。因此，外植体必须经过严格的表面灭菌处理。外植体的灭菌是利用各种化学药剂对外植体所带的杂菌进行杀灭，从而实现灭菌。灭菌后外植体需在无菌的条件下接种到培养基上。

三、实验材料及用具

1、实验材料：植物的茎、叶。

2、实验药品：培养基、75%酒精、次氯酸钠、无菌水等。

3、培养基：MS固体培养基。

4、实验用具：超净工作台、烧杯、镊子、剪刀、酒精灯、记号笔等。

四、实验内容

（1）、对采来的植物材料进行适当的预处理。除去不需要的部分，将所需部分切割至适当大小，置自来水龙头下流水冲洗几分钟至几小时，主要视植物材料清洁程度而定。这在污染严重时特别有用。

（2）、用洗衣粉水（1~2角匙洗衣粉/100 ml水）等浸洗上述植物材料约5 min，再用自来水冲净洗衣粉水。这是进一步减少污染的处理。

同时配制消毒液：50%次氯酸钠溶液。

（3）、将接种用具、无菌水等从80℃烘箱中或直接从高压灭菌器中取出，置于超净工作台上。打开超净工作台中的紫外灯，在进行紫外线灭菌处理至少30 min后关掉紫外灯。

（4）操作人员洗手擦干，换上洁净工作服，戴上帽子以免头发散落以及带来污染。坐到超净台前，并将装有经湿热灭菌培养基的培养瓶、配好的消毒液、洗净沥干的植物材料置于超净工作台上，用70%酒精棉球擦手与器具外壁，即可对经上述预处理的植物材料进行表面灭菌处理，自此以后各步均须在超净工作台上操作。

（5）具体首先将经上述预处理、沥干水的植物材料放入广口瓶或烧杯，向其中倒入新鲜配制的灭菌液，开始计算灭菌时间。也可在使用上述灭菌剂之前，先将植物材料浸于70%乙醇灭菌10~30秒。

（6）在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动，以促进植物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。在灭菌时间结束前1 min时，即可开始用玻璃棒等轻轻压住植物材料将消毒液慢慢倒入废物缸，注意勿使植物材料滑出。接着立即倒入适量无菌水，轻搅植物材料以清洗去除灭菌剂残留。一般表面灭菌时间的计算是从倒入消毒液开始，到倒入无菌水为止。无菌水的清洗时间每次约3 min；清洗5次。

（7）倒出、沥去最后一次清洗用水，开始进行植物材料的切割及接种。逐一取出经上述灭菌处理的植物材料，置于下面垫有经灭菌处理的培养皿（或小白瓷碟）的无菌纱布或滤纸上，左手拿小镊子，右手拿解剖刀，切除各切段或切块上被灭菌剂毒坏的部分。如有必要，也可再行切分。在完成切割后，将解剖刀和小镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一切割再用。

（8）接着，左手拿培养瓶，将培养容器口外壁在靠近酒精灯外焰处转燎数秒，以将其可能带有的微生物等固定于原处；在酒精灯焰附近处，用右手拇指与食指配合将瓶塞打开，并将其夹于左手无名指与最小指之间；再将培养瓶口在酒精灯焰上轻转灼烧灭菌；以右手拇指与食指配合，用大镊子夹紧一外植体准确送入培养容器，并将其轻轻地半插入固体培养基；将大镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一操作再用；将培养瓶口及瓶塞分别在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒；盖好瓶塞，旋紧，将其置于超净工作台的适当位置。

（9）在完成了该第一只培养容器的外植体接种操作后，用70%乙醇对超净工作台的台面进行擦拭灭菌，接着再进行第二只培养容器的外植体接种及超净台台面的灭菌，直至全部完成。