实验技术考核总结(全)_专业技术考核总结
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一、与进实验室制度相关
实验室预约制度
凡申请使用医药研究院科研平台的人员必须办理登记手续，具体流程如下：
1.填写“医药研究院科研平台登记表”；
2.实验室各项规章制度学习及考核；
3.大型仪器培训及考核；
4.填写“进入实验动物房申请表”；
5.阅读知情同意书并签字；
6.院长审核。
二、大型设备仪器使用管理制度
1.实验室由专人负责仪器设备的操作,为科研人员服务；若学生独立上机操作,必须接受
培训并经考核合格才能上机。
2.上机测试必须预先预约登记，在规定时间内完成测试实验。
3.不得用仪器设备的计算机做与仪器功能无关的工作。严格按各台仪器的操作规程操
作。
4.仪器设备使用完后送样人员必须填写使用记录，包括测试项目、机时数（或费用），并签字。
5.若仪器设备发生故障，须及时通知有关负责人，操作人员不得自行处理。
6.本中心实验室各台仪器设备的说明书、有关资料均有固定保存处，阅读完后请放回
原处，勿带出室外。
7.严禁在实验室水槽中排放腐蚀及剧毒溶液，倾倒少量废液必须用大量水冲洗。实验
结束后，注意检查各气体、水、电是否关闭，并搞好实验室台面及地面的卫生。
三、高压灭菌锅使用的注意事项
答案要点：
1、高压前锅底水需没过横杠；
2、高压前注意废液缸废水水位在high与low间
3、高压时选择模式。无液体时选择固体模式，物品可直接放入，有液体时选择液体模式，若液体是用塑料瓶盖封口，则需旋松瓶盖，若为橡胶瓶盖，则需插上针头中和内外压差，防止爆炸。
4、高压结束后需等到压力表压力显示为零时才能开锅。
四、WB基本步骤
答案要点：
1、蛋白质的样品制备；
2、测定蛋白浓度；
3、SDS-PAGE电泳【①制胶：分离胶静置约40min凝固，浓缩胶（插入梳子）约静置30min凝固；②预电泳；③样品准备；④加样；⑤电泳：80V恒压 浓缩胶约（30min），100V恒压 分离胶约（60min）】；
4、转膜【①切胶；②剪膜和滤纸；③按如下顺序制作“三明治”：黑→海绵→三层滤纸（小于胶）→凝胶→PVDF膜→三层滤纸→海绵→白→放入转膜槽，黑面对黑面，400mA转膜，约60min】；
5、膜的封闭：TBST洗三次，每次约5min，5%脱脂奶粉封闭1h；
6、TBST洗三次，每次约5min；
7、一抗孵育（4度过夜）；
8、TBST洗四次，每次约5min；
9、二抗孵育（室温1h)；
10、TBST洗四次，每次约5min；
11、显色（A液：B液=1：1）；
12、曝光。
五、离体组织灌流技术实验注意事项（李勇老师）
1.2.3.4.5.6.KHS须新鲜配制，如出现沉淀，弃用。取材时，尽量避免牵拉组织。实验前要调整好气体进气量，实验开始后尽量避免调整进气。初始张力设置参考相关文献报道。实验完成后要清洗进气口，避免堵塞。数据采集系统工作期间，不能频繁使用电脑，避免程序运行干扰软件采集数据。
六、实验动物的基本操作--SPF的概念及相关问题（刘秀芬老师）SPF动物：即无特定病原体（Specific pathogen Free,SPF）动物，是指机体内无特定的微生物和寄生虫存在的动物，但非特定的微生物和寄生虫是容许存在的。一般指无传染病的健康动物，是目前国外使用最广泛的实验动物。
七、免疫组化（尧青老师）
组织化学的基本原理：
化学反应
化学试剂+拟检物质—————→ 反应产物沉淀（有色）（组织切片或细胞涂片）（拟检物质所在处）石蜡切片步骤：
取材（大小5mm*5mm*2mm时间：迅速温度：冰浴）→固定（甲醛）
→脱水（梯度酒精）→透明（二甲苯）→浸蜡（石蜡）→包埋（石蜡）
→切片（石蜡切片机）→粘片（载玻片）→烤片（烤箱）
HE染色程序：
二甲苯Ⅰ 10 min→二甲苯Ⅱ10 min→无水乙醇Ⅰ 5 min→无水乙醇Ⅱ3 min
→95%乙醇 3 min→85%乙醇3 min→流水冲洗2 min→苏木素3-5min
→流水冲洗 1 min→1%盐酸乙醇数秒→流水冲洗1min→碳酸锂2min
→流水冲洗3-10min→伊红染色 数秒→85%乙醇30 s→95%乙醇Ⅰ1min
→95%乙醇Ⅱ 3min→无水乙醇Ⅰ3 min→无水乙醇Ⅱ 3 min→二甲苯Ⅰ 3 min
→二甲苯Ⅱ3 min→中性树胶封片
镜下观察：细胞核蓝色，细胞浆红色，背景粉红色
八、PCR的基本原理、步骤（李敏才老师）
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
试管中进行的DNA复制反应，依据
① DNA半保留复制的机理；
② 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质；
通过人为控制体外合成系统的温度，使
① 双链DNA变成单链，② 单链DNA与人工合成的引物退火，③ DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的片段富集106～109倍。所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
九、细胞培养（郭霜老师）
1.吸光培养瓶中的培养液
2.加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）
静置2-10 min（显微镜下动态监测）。
3.吸去胰蛋白酶液，加入培养液。
4.用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。
5.吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。
6.加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。.将后者放入培养箱中培养。细胞冻存方法：
1．预先配制冻存液：含20%血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；
2．取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～5 ×106细胞/ml)；
3．加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。
慢冻程序：
1.先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。
2.接着置于-20℃冰箱，约30～60min。
3.置于-80℃超低温冰箱中放置过夜。
4.置于液氮罐中长期保存。
（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。
（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。
（3）低速离心10分钟。
（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
十、膜片钳技术的四种基本记录方式：（邱春玉老师）
将电极接触细胞膜，轻轻给予负压吸吮，达到高阻封接，就形成了细胞贴附记录模式。
形成细胞贴附记录模式后，采用继续施加负压或电击的方法打破细胞膜，电极内液与细胞内液直接相通，即形成全细胞记录模式。
从细胞贴附模式将微电极迅速提起，脱离细胞，则膜片就从细胞体上被切割分离下来，得到分离的膜片，形成膜内面向外记录模式。
4、外面向外记录模式在形成全细胞记录模式后，将电极缓缓提起，逐渐脱离细胞，同样因为细胞膜具有流动性，黏着在电极尖端上的细胞膜会自动融合，这样细胞外面就朝向电极尖端外，形成外面向外记录模式。
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