分子生物学技术总结1_分子生物学总结1
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分子生物学技术总结
关键词：分子 技术 原理 应用
摘要:本文主要是描述分子生物学技术的基本原理，通过其原理我们可以深刻的理解其功能
还有实际操作的过程。另外还列举了每项技术所给我们带来的好处及其现实的应用，通过实际的例子我们可以清楚的了解到其强大的功能和深远的影响以及将来的发展前景，充分体现出了科技给人类带来的创新及利益，可以说分子生物学技术将会改变人类未来的生活环境和生活条件，为人类的长期发展起到了不可替代的作用。下文将详细的介绍部分分子生物学的技术及其应用。
1.核酸分子杂交技术：具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下(适宜的温室度及离
子强度等)可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针，待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素，生物素或其他活性物质标记的能与待定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为CDNA探针，基因组探针，寡核苷酸探针，RNA探针等。
其应用：核酸分子杂交技术可以用来诊断弓形虫病分子。
2． 寡核苷酸微点隈杂交：是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使他共价结合与
持物表面，与平均长度为20-50nt的混合RNA或cDNA探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度mRNA的检测，以区分基因家族不同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。但有工作量较大，成本较高，速度较慢的弱点。
其作用：激发细胞潜在的活性，寡核苷酸一方面能激发巨噬细胞的活性，巨噬细胞相
当于城市里的“大垃圾车”。专门处理衰老和死亡细胞。另一方面，寡核苷酸就像一把剪刀，定位寻找并及时剪断病毒基因链，快速吞噬病毒细胞，阻止病毒基因的转录和翻译，保护正常细胞不受侵害。
3.分子克隆技术： 在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类。其作用：克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一，克隆技术被誉为“一座
挖掘不尽的金矿”，它在生产实践上具有重要的意义，潜在的经济价值十分巨大。首先，在动物杂种优势利用方面，较常规方法而言，哺乳动物克隆技术费时少、选育的种畜性
状稳定；其次，克隆技术在抢救濒危珍稀物种、保护生物多样性方面可发挥重要作用，即使在自然交配成功率很低的情况下，科研人员也可以从濒危珍稀动物个体身上选择适
当的体细胞进行无性繁殖，达到有效保护这些物种的目的。培育大量品种优良的家畜，如培养一些肉质好的牛、羊和猪等，也可以培养一些产奶量高，且富含人体所需营养元
素的奶牛。利用克隆等生物技术，改变农作物的基因型，产生大量抗病、抗虫、抗盐碱
等的新品种，在短时间内培育出大量农作物、从而大大提高农作物的产量。
4.核酸序列的测定：目前最常用的手工DNA序列测定技术，仍然是Sanger等(1977)提出的酶法，也称双脱氧末端终止法。这种方法生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核
苷酸，每组核苷酸都有共同的起点，却随机终止于一种(或多种)特定的残基,形成一系列
以某一特定核苷酸为末端的长度，各不相同的寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由
这个特定碱基，在待测DNA片段上的位置所决定。然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰
胺凝胶电泳，经放射自显影后,从放射自显影胶片上，直接读出待测DNA上的核苷酸顺
序。
其作用：根据杂交膜的显色情况来判断：以阳性对照样显出的颜色为标准，样品的颜色
与阳性对照颜色相同或相近，则样品为病毒携带者；样品的颜色比阳性对照颜色深，则
样品为已发病或临死状态；样品不显出颜色，则样品为不带病毒（阴性）
5.PCR技术： 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双
链或经PCR扩增
形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃
左右，引
物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为
反应原料，靶
序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保
留复制
链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链
又
可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基
因扩增放
大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。其作用：由于微生物的DNA具有高度特异性，它决定了各个物种的千差万别，利用一
特性，PCR技术对性病的病原体进行诊断，具有操作简便、报告结果迅速、敏感性和
特异性高等特点。但PCR技术检查也会出现假阳性结果，临床主要结合病史、症状、体征等综合分析判断，才不致贻误诊断。
6．电泳技术：电泳就是带电荷的样品在电场力的作用下，以不同的迁移行为而彼此得以分
离的方法。根据其载体介质的不同可以分为等电聚焦电泳、梯度电泳、纸上电泳、醋酸
纤维薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳等。
许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子结构机器所在介质的pH和组成。
由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及相对分子质量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速率也有差异。因此，在一定时间内各组分移动的距离也
不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。
在电泳的过程种药品会受到电场力、分子筛作用、静电吸附作用、共价结合作用等等方
面的作用力。药品在这些作用力的综合作用下，泳动的速度产生差异，从而将不同的组
分分 离开来。
电泳的介质不同，则电泳的功能也不大相同，其所最适用的方向也是不一样的，最终检
测的指标也是不一样的。等电聚焦电泳常用于测定蛋白质的等电点，他最后测定的指标就是pH值。琼脂糖凝胶最常应用于核酸的检测之中，最后是以分子量的大小来衡量电
泳结果的。
其作用：
a)主要应用于分离各种有机物（氨基酸、多肽、蛋白质、酶、脂类、核苷、核苷酸、核酸等）。
b)可用于分析物质的纯度。
c)用于测定相对分子量。
d)与层析连用可用于蛋白质结构分析。
7.基因转染技术：将特定的遗传信息传递到真核细胞中，这种能力不但革新了生物学和医
学中许多基本问题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展，并使基因治疗成为可能。目前基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因
治疗与转基因动物等研究。本部分将介绍目前基因转移的主要方法；重点介绍基因转移的病毒方法的基因转染技术。
其作用：用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了化学物质的污染，OD26
0/280比值应在1.8以上。应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准，目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。
8.荧光原位杂交技术：应用核素标记核苷酸制备探针，通过放射自显影检测杂交信号。应
用核素标记的探针其敏感性可以检测到中期染色体上几百个碱基的单拷贝靶核苷酸序
列，敏感性虽高，但定位不够精确。FISH具有探针稳定、操作安全，可快速、多色显示
多个不同探针的杂交信号等优点。FISH的灵敏感与探针标记方法和检测仪器性能有关，探针标记时掺入的修饰核苷酸比例直接影响杂交信号强度。FISH探针一般采用随机引物
法或切口翻译法，如将PCR技术引入FISH探针标记，可使其灵敏度提高到0.25kb。
应用慢扫描CCD配合影像处理理软件，增强信噪比，有利于检测微弱信号，如应用TS
A系统能将杂交信号再放大1000倍，可用于单拷贝基因的定位。FISH分辨率大约为1-
3Mb,如果应用强变性剂处理染色体，让DNA分子从蛋白质中分离出来，使双DNA完全
伸展并粘附在玻片上，经引处理后，分辨率可达1-2kb。还可采用对分裂中期染色体进
行显微解剖法以提高分辨率。FISH的另一个特点是可以联合庆用地高辛、生物素等多种
标记系统，在一次杂交中可检测多种探针在染色体上的位置及探针间的相互关系，即多
色FISH或多靶FISH。
其作用：被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、易位重排及缺失等的检测，在肿瘤
诊断和鉴别诊断、预后和治疗监控等方面都有重要意义。
参考文献：《分子遗传学》《分子克隆》《现代分子生物学》《微生物学》《基因9》《分子和细胞生物学》《系统生物学》《分子生物学技术》《生物学基础》《细胞工程》《免疫学》
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