MTT法总结_mtt方法总结

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MTT法总结

一： 所用仪器和试剂

1.所用细胞

EA.hy926人脐静脉内皮细胞融合细胞

2.材料

96孔板、离心管、1.5ml灭菌EP管

3.主要试剂

DMEM基础培养基（3g碳酸氢钠、100mg氨苄青霉素、50mg链霉素、DMEM高糖培养基）、重组人VEGF、MTT粉末、DMSO、胎牛血清、25%胰蛋白酶

4.主要仪器

超净操作台、细胞计数仪多功能酶标仪CO2培养箱平板离心机倒置显微镜微量振荡器。

二、实验过程

1、MTT溶液配制；

250mg MTT溶于50 mL PBS中，待完全溶解后（本次实验为促进溶解，将试剂瓶放入超声清洗仪中超声，溶解效果良好，有无负面作用有待验证），过滤除菌，分装，-20℃贮存；（MTT应避光贮存，用锡箔纸包着）

2、实验步骤

1、制备单细胞悬液

将细胞放在37℃、5%C02培养箱中培养，镜下观察，发现细胞均呈镰刀状，分布较密，弃去瓶中原有的培养基，用PBS清洗两次，弃去，加入2ml 0.25%胰蛋白酶溶液于37℃培养箱中消化3min，转入刻度离心管中1000rpm离心3min，再加入2ml新鲜完全培养基（DMEM+10%FBS）重悬后，用细胞计数器计数6.81×105cells/ml。

2、铺板

将重悬后的细胞稀释至4×10cells/ml，96孔板中每孔加100ul同时设置空白对照组（即不含细胞，只加培养基），边缘孔用PBS补齐，于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后加待测物。

3、加不同浓度的VEGF溶液 4

用DMEM+1%FBS培养基将自制的30ug/ml VEGF分别稀释到：5000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml。

用枪吸出96孔板中原有培养基，加入适量的PBS清洗一次，加入不同浓度的VEGF溶液，每孔100ul，每个浓度设置三个平行孔，同时设置空白对照和阳性对照（含细胞，及已知有效的avastin溶液）、阴性对照（含细胞，但不含所制抗体药物），放入培养箱中培养。

培养72h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液12ul，在培养箱中继续培养4h。然后于平板离心机中离心，之后吸出孔中溶液，加入150ul /孔DMSO溶液，再于微量振荡器上振荡10min，之后在酶标仪上检测570nm和630nm处的孔板的吸光度值，则每个孔的吸光度值即为A570减去A630。