荧光法 叶绿素测定小结修改_叶绿素荧光测定方法

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此文仅试用于南海所LTO李芊课题组基本参数叶绿素的测定。

1.方法探究：在酸性条件下叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇，这里不讨论脱镁叶绿素。在讨论叶绿素的测定方法时，注意一下叶绿素提取的完全性、测定数据的稳定性、实验操作的简便性等。叶绿素是脂溶性色素，一般的有机溶剂都可以提取，包括丙酮、乙醇、氯仿、等等，丙酮具有一定的毒性，最好的实验试剂是无水乙醇（水的含量越低越好）但是根据叶绿素的极性，最好的还是丙酮，叶绿素在丙酮溶液中的溶解度最大。常用的叶绿素的测定方法包括：高效液相色谱法，活体叶绿素仪法，光声光谱法、原子吸收光谱法等等，但是这些包括国标（如超声波法、反复冻融法、延时提取法、热丙酮法、丙酮加热法、热乙醇法、混合溶剂法）在内的方法耗时长、过程复杂、提取不完全等等，叶绿素是植物在紫外光照射下唯一可发射红色荧光的物质，根据这个原理可采用荧光法进行叶绿素的定量分析，优点是灵敏度高、选择性好，成为比较主流的一种方法。

2.实验原理：首先通过分光光度计测定叶绿素标准样品在不同波长下的吸光值，采用公式算出叶绿素标准样品的浓度；将叶绿素标准品进行序列稀释，用Turner Design Trilogy荧光仪在“非酸化”模块下测定相应的荧光值，绘制标准曲线（线性相关系数达到0.999-1之间）。通过相关的系数的换算得到待测样品的浓度。3.具体操作过程：

A． 前期处理：叶绿素很不稳定，对光、热较敏感，所以在采样处理、保存的过程中要注意采用铝箔进行避光处理，同时用冰箱-20℃以下冷冻保存。B． 标准曲线：购买Sigma叶绿素a标准样品，配制5个浓度梯度（标样的浓度在分析的样品浓度范围:

内）叶绿素a标样的浓度用分光光度计测量，按下面公式计算：

式中：Ca——样品中叶绿素a的含量，ug/L；

E——在各个波长下测得的吸光值减去750nm下的吸光值； v——样品提取液体积，mL； V——样品过滤体积，mL； L——比色皿光程，cm。Ca(11.85*E6641.54*E6470.08*E630)vVL注意：需要扣除90%丙酮的本底值。

依次计算各个浓度梯度的浓度值（注意：测定低浓度叶绿素时，分光光度计不稳定），并采用Turner design测量其荧光值，作荧光值与浓度的线性相关曲线，计算线性相关系数。

C． 样品萃取：登记待测样品及记录标签（约120个/天），按照记录顺序摆好，用Milli-Q水配制90%丙酮溶液（样品个数*10ml，可多配30ml），用镊子将带有叶绿素的滤膜打开并迅速转移至15ml离心管中，加入10ml的丙酮，盖好（此过程尽量避光）。放入冰柜冷冻保存，经过24小时的萃取处理后方可进行下一步操作。

D． 测定：将24小时萃取处理后的丙酮溶液经震荡30s（震荡要充分）后进行离心（离心10min，r=4000rpm），平稳取下后在Turner design测定荧光值，整个测定过程在通风橱中避光进行，测定三次，依次记录。

E． 后期处理：由于丙酮易挥发，对测量完毕的离心管要进行密封打包处理。测定之后的数据取三次测定之后的平均值，同时要转换成叶绿素a的浓度。

总结：经过一星期的努力，总算是完成了大部分叶绿素的测定，有很多波折（仪器故障，仪器不稳定等等），基本上数据符合我们的一个大致估计。叶绿素与营养盐的测定是我们的基础数据，同时在叶绿素与营养盐的测定过程中也需要大家的一起努力，使结果尽可能的精确。