南京师范大学生命科学学院《细胞工程》期末重点总结_细胞工程重点总结

2020-02-28 其他工作总结下载本文

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南京师范大学生命科学学院细胞工程期末重点

一．名词解释

发育阻滞：

体外受精的早期胚胎在体外发育过程中，往往会停滞在某一阶段不再发育，此现象称为发育阻滞。胚胎移植：

也称受精卵移植、借腹怀胎，是指将良种母畜配种后，从其生殖道内取出受精卵后早期胚胎，移植到同种的、生理状态相同的母畜体内，使之继续发育称为新个体的技术。组织工程：

指应用工程学和生命科学的原理和方法来研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物的一门科学。人-鼠嵌合抗体：

就是用人源性抗体的一部分代替鼠源性抗体的一部分，使之保留对抗原的特异性，又具备与补体和细胞结合的功能，并减少异源性蛋白的抗原性。细胞融合：

在离体条件下，用人工方法将不同基因型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的过程。ES细胞：

即胚胎干细胞，将细胞团的细胞分离出来进行培养，在一定条件下这些细胞可在体外“无限期”地增值传代，同时还保留其全能性的细胞。乳腺生物反应器：

利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物，指导外源基因在乳腺中表达，并从转基因动物的乳液中获得重组蛋白。细胞全能性：

指细胞分裂分化后，仍具有形成完整有机体的潜能或特性。Ips（诱导性多能干细胞）：

利用病毒载体将四个转录因子（Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。胚胎分割：

将一枚胚胎用显微手术的方法分割为二分、四分甚至八分胚，经体内或体外培养，然后移植入受体中，以得到同卵双生或同卵多生后代的技术。核移植：

利用显微操作技术，将某一特定细胞的核转移和嵌入另一细胞中的过程。细胞系、细胞株：

细胞系是由原代培养经初步纯化。获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。细胞系经过进一步的克隆化，便得到由单一细胞组成的细胞株。

二、问答题

1.如何鉴定转基因动物？

1.分子杂交

Southern 印迹杂交技术是通过探针和已结合于硝酸纤维素膜(或尼龙膜)上的经酶

切、电泳分离的变性DNA 链杂交,检测样品中是否存在目的DNA 序列的方法。该法不仅灵敏而且准确,因而广泛用于转基因阳性鼠的筛选和鉴定。当转入基因与内源基因组DNA有较高同源性时,仍可用此法。,此法对样品的质量和纯度要求较高,操作烦琐,费用也较高。

通过直接将变性的待测DNA 样品点在尼龙膜(或硝酸纤维素膜)等固体支持物上,然后2.斑点杂交

和探针杂交,从而检测样品中是否存在目的DNA 序列。根据点样方式—和样品点的形状不同可分为斑点杂交、狭缝杂交(slot blot hybridization)、打点杂交(spot blot hybridization)。当目的基因与内源基因组DNA 无同源性时可用它,为避免假阴性,可同时用质粒DNA(1～l0pg)作阳性对照。该方法在分析基因组DNA 时,对样品纯度要求低、快速、简便、经济、灵敏度高(能从2μg～5μg 的基因组DNA 中检出单拷贝基因),尤其对大批子代动物的粗筛颇具优越性,应作为首选方法。但该方法易出现假阳性。PCR 技术是DNA 体外扩增技术,基本原理同体内DNA 的复制一样,均需经过DNA 模板

解链、引物、结合及模板指导下的链延伸三个过程,在PCR 反应中是靠温度的调整和聚合酶的共同作用完成的。若PCR 体系中有一对方向相对的引物,通过反复重复变性、复性、延伸过程,则在短时内可将两引物间模板扩增至百万倍。由于PCR 所需样品少,灵敏度高而且操作简便因而逐渐用于转基因动物外源基因整合、表达的检测。可极大提高转基因效率,减少人力物力的浪费。但该尤其在大型转基因动物研究中,用PCR 先对着床前的胚胎筛选,再将已证实携带外源基因的胚胎植入母体, 方法要求待分析的基因组DNA 样品应尽可能纯化,否则会干扰本反应,降低检测的灵敏度和重复性;此外用于大批量检测时,费用较昂贵。

染色体原位杂交是确定转基因在染色体上确切位置的重要手段,其原理是利用碱基互

补的原则,以放射性同位素或非放射性同位素标记的DNA 片段作探针, 与染色体标本上的基因组DNA 在“原位”进行杂交,经放射自显影或非放射性检测体系在显微镜下直接观察出目的DNA 片段在染色体上的位置。最早同位素标记多采用放射性较低的3H、35S、及125I ,它们具有定位精确的优点,但放射自显影时间长而且操作较麻烦,随着荧光显微镜技术的发展,尤其是计算机图像处理系统的应用,增强了对荧光信号的分辨率,促进了非同位素在染色体原位杂交中的应用。3.PCR 4.原位杂交

2.细胞同步化培养有哪些方法？基本作用原理分别是什么？ 1.选择细胞同步化

1）M期细胞震碎摇落法

处在有丝分裂期的细胞形状变圆，单层贴壁生长的细胞的附着性降低，摇动或拍打培养瓶很容易使这些细胞脱落。

2）离心洗脱法

细胞在进行分裂时，细胞体积呈线性增加，利用洗脱离心机可以将体积大小不同的处于不同时期的分离开来。3）梯度沉降法

利用含血清或蔗糖的梯度溶液可以将体积不同、处于不同分裂时期的细胞分离开来

2.诱导细胞同步化

1）血清饥饿法

将血清浓度降到一定限度，使细胞仅能存活而不能分裂，可以获得大量处于G1期的细胞。

2）异亮氨酸营养缺乏法

培养基中缺乏异亮氨酸，细胞将被阻止到G1期 3）DNA合成抑制阻断法 DNA合成抑制剂均能将细胞阻止在S期 4）秋水仙素阻断法

利用秋水仙素抑制纺锤丝的形成，可以使细胞分裂停止在有丝分裂中期

3.简述ES细胞建系的主要操作步骤

1.ES细胞的分离

从着床前（孕3~5天）的胚泡中分离内细胞群（ICM）细胞。分离方法主要有： 1）免疫学方法 2）免疫外科学方法 3）组织培养法 4）显微外科学方法 2.ES细胞的分离培养

a.饲养层的制备及分化抑制物的选择

小鼠成纤维细胞无限系（STO）小鼠原始胚胎成纤维细胞（PMEF）

（常用的饲养层是由小鼠成纤维细胞无限系（STO）或小鼠原始胚胎成纤维细胞（PMEF）

制备而成。STO和PMEF细胞可以分泌成纤维细胞生长因子FGF、分化抑制因子LIF，这些因子有助于ES细胞增殖，而且能抑制细胞的凋亡和分化。也可用绵羊、山羊的输卵管或子宫上皮、牛的颗粒细胞、子宫成纤维细胞等作为分化抑制培养基）

（将分离得到的早期胚胎或PGC置于饲养层或条件培养基上，在5%CO2、37~39°C条件下进行培养。传代时一般用胰酶EDTA消化，用吸管将其打散成单个细胞，然后移入新的饲养层上，培养几天后可出现新的克隆点，在其分化之前可再进行传代。）b..早期胚胎及PGC的培养和ES细胞的分离传代

4.单克隆抗体和多克隆抗体的区别是什么？应用上有何不同？

区别：单克隆抗体是由一个抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产

生的抗体。多克隆抗体是由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。

应用：单抗特异性高，而且一旦制备成功就可以永续生产完全一致的抗体，能广泛那地

用于多种应用（比如用作诊断试剂、纯化抗，肿瘤的治疗等），并且完全保证抗

原的一致性。多抗在特异性上无法与单抗相比拟。但多抗的灵敏度比较高。5.细胞培养过程中，支原体污染的危害及鉴定

危害：支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，具有类病毒作用。在细胞培养初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略。

鉴定：1）荧光技术检测

支原体含有DNA，能与一种荧光染料Hoechest 33258 特异性结合，可根据

细胞表面的荧光，来显示细胞是否被支原体污染。

2）支原体培养法

3）DNA分子杂交

（危害：支原体污染后，因它们往往无致死细胞病毒而可与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上往往给人以“正常”的感觉，实则细胞能受到多方面的潜在影响，如引起细胞变形、影响DNA合成、抑制细胞生长等。

3H-胸腺嘧啶掺入、支原体培养法及PCR法等。）

鉴定：相差显微镜检测法、DNA荧光处理法、电镜检测法、低张处理地衣红染色观察、免疫学方法、6.克隆羊“多利”成功的意义

1.证明一个已经完全分化的动物体细胞仍然保持着胚胎细胞的全部遗传信息 2.可以按照人的意志趣改造、生产物种

3.利用克隆技术复制哺乳动物的技术障碍已经被突破，在理论上已经成为可能

（解决了使核供体细胞与核受体细胞同步的方法，解决了用体细胞做核供体与转基因的问题）

7.简述Cre2/loxP系统作用原理及应用

原理：Cre重组酶能识别34bp的特异序列loxP，介导两个loxP之间的序列发生重组，从而将两个loxP位点之间的序列删除。（此过程不需要任何其他辅助因子的帮助。loxP 的位置和方向不同，Cre重组酶介导重组形成的产物亦不同，可以导致染色体的倒位、删除和

易位，实现染色体的定点操作，克服了用放射线诱导产生的突变不能定位的缺点）

应用：

建立疾病动物模型来模拟人类的某些疾病，可以用来研究肿瘤抑制基因的识别和疾病的治疗诊断 8.HAT选择原理

正常及普通癌细胞不但具有利用培养液中的谷氨酰胺和尿核苷单磷酸合成DNA的能力，而且当这条主要途径被氨基喋呤（A）阻断时，还具有利用培养液中现成的次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶脱氧核苷（T）在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的作用下，借此应急通路来合成DNA的能力。9.简述脐带血移植的优缺点

优点：

1.纯净：较少受到放射线、病毒、药物污染 2.再生力强：干细胞生命力、分化能力强

3.及时性：许多疾病治疗时效相当重要，解冻马上可用 4.来源容易：脐带血容易取得，不伤婴儿及母体 5.低排斥性：移植物抗宿主疾病程度较轻

6.组织相容性大：HLA相容之要求比骨髓、外周血干细胞低缺点：

1.一单位脐血所含的干细胞数目不足，对一位成人体重而言，有些人是不够用的 2.植入后恢复时间长，感染风险高，隔离住院期间长

3.HLA相容性要求虽不高，但慢性移植物抗宿主疾病仍会发生。虽急性病减少很多，但是免疫耐受性仍要克服。

4.一般移植以非亲属间的移植为主流，然而受限于脐带血库的成立相当昂贵，HLA

相容性也要求到DNA水平。手足间的移植靠机运，而自体移植的几率更小，目

前世界上尚无足够的脐带血自体移植之资料或经验可供参考。

10.细胞培养过程中，常用的消化液有哪些？培养所需的动物血清作用是什么？

细胞消化液：

1）胰蛋白酶溶液 2）EDTA-Na溶液 3）胶原酶溶液

4）其他：链霉蛋白酶，骨胶原酶，透明质酸酶

动物血清作用：

1）提供基本营养物质 2）提供贴壁和扩展因子 3）提供激素和各种生长因子 4）提供结合蛋白

5）对培养基中的细胞提供某些保护作用

11.简述单克隆抗体的制备过程及其主要原理

制备过程：

1.致敏淋巴细胞的准备 2.骨髓瘤细胞的准备 3.饲养层细胞的准备 4.细胞融合 5.选择性培养

6.特异性抗体的检测 7.杂交瘤细胞的克隆化 8.杂交瘤细胞的冻存和复苏 9.单克隆抗体的大量制备 10.单克隆抗体的纯化

主要原理：要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体

12.为何要对鼠源性抗体进行改造使之人源化？

鼠源性单克隆抗体的局限性：

1.应用后很快就会被消除出人的循环系统

2.鼠源性抗体一般无法有效地激发宿主的免疫防卫系统

3.大多数情况下，还会引发人对于鼠源性抗体本身的免疫反应，即人的抗鼠反应

人源化后，使人的抗鼠反应大大降低，更好地运用到疾病的治疗

13.简述X、Y精子的常用分离方法及其原理

1）沉降法

X、Y精子在体积和质量上相差很大 2）离心沉降法

X精子的DNA含量高于Y精子，导致X精子的密度及重量大于Y精子，在离心时X精子的沉降速度快于Y精子 3）电泳法

依据X、Y精子表面膜电荷的不同，通过电泳时X、Y精子在电场中向不同电极移动而达到分离的目的 4）免疫学分离法

利用H-Y抗体检测精子质膜上存在的H-Y抗原，以此来分离X精子，Y精子 5）流式细胞分离法