扬州大学畜产品加工总结_扬州大学培训心得体会

2020-02-28 其他工作总结下载本文

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第一章

绪论

1，仪器分析：用精密分析仪器测量物质的某些物理或物理化学性质以确定其化学组成和物理化学分析方法。

2，仪器分析的特点：①分析速度快，自动化程度高；②灵敏度高，试样用量少；③用途广泛，能适应各种分析的要求；④选择性高（可以选择或调整测定条件，选择性测定某组分）。

第二章

样品前处理

1，样品前处理的概念和目的：

①概念：是指样品的制备和对样品中待测组分进行提取、净化、浓缩的过程。

②目的：是消除基质干扰，保护仪器，提高方法的准确度、精密度、选择性和灵敏度。2，凝胶渗透色谱（GPC）：也称体积排斥色谱（SEC），依据①立体排斥理论；②有限扩散理论；③流动分离理论等机理，主要利用多孔物质按分子体积大小进行物质分离。3，固相萃取（SPE）：又称固相分离（SPI），是利用固体吸附剂对液体样品中的待测组分进行吸附，使其与样品基体和杂质化合物分离，再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离、富集目标化合物的目的。4，液液萃取（LLE）：是利用待测组分与样品杂质在互不相溶的两相中的溶解性差异进行净化的方法。

5，SPE的一般操作程序：①活化吸附剂；②在萃取样品之前要用适当的溶剂淋洗固相萃取小柱，以使吸附剂保持湿润，可以吸附目标化合物或干扰化合物。6，不同模式SPE柱活化所用的溶剂？

①反相固相萃取所用的弱极性或非极性吸附剂，通常用水溶性有机溶剂，如甲醇淋洗，然后用水或缓冲溶液淋洗。也可以在用甲醇淋洗之前先用溶剂（如己烷）淋洗，以消除吸附剂上吸附的杂质及其对目标化合物的干扰；

②正相固相萃取所用的极性吸附剂，通常用目标化合物所在的有机溶剂（样品基体）进行淋洗；

③离子交换固相萃取所用的吸附剂，在用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来淋洗；在用于极性溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂淋洗后，再用适当pH 并含有一定有机溶剂和盐的水溶液进行淋洗。7，固相微萃取（SPME）：是在固相萃取技术基础上发展起来的一种新的萃取分离技术，原理与固相萃取相似。8，加速溶剂萃取（ASE）：是一种在提高温度和压力的条件下，用有机溶剂萃取的自动化方法。原理是选择合适的有机溶剂、通过增加温度（50~200 ℃）和压力（10.3~20.6MPa）来提高萃取过程的效率。9，微量化学法（MICCM）：该体系是用于残留物分析（或其他化学实验）中样品处理的一种新的工作体系，分析中使用的分析试样量小，使用的设备器具和操作方法均不同于经典的MACCM体系。

10，超临界流体萃取：采用超临界压力，以二氧化碳流体代替有机溶剂，并发挥其在临界、超临界状态下，对弱极性物质（动植物挥发油、脂）有特殊的溶解能力的特性，在常温下对动植物的有效组份和精华进行萃取和分离，使生物活性不被破坏，产品中无溶剂残留等污染。

超声波萃取：而是在溶剂和样品之间产生声波空化作用，导致溶液内气泡的形成、增长和爆破压缩，从而使固体样品分散，增大样品与萃取溶剂之间的接触面积，提高目标物从固相转移到液相的传质速率。微波萃取：是微波技术与萃取技术相结合产生的新技术，在萃取过程中用微波来提高萃取效率。通常萃取溶剂和固体样品中目标物由不同极性的分子组成，萃取体系在微波电磁场的作用下，具有一定极性的分子从原来的热运动状态转为跟随微波交变电磁场而快速排列取向。

自动化核酸提纯系统：多采用固相物质吸附分离技术。样品被含有硫氰胍(GuSCN)的溶解液溶解。样品中的细胞、细菌和病毒被溶解，同时，蛋白质如核酸酶被变性和失活。核酸被释放出来并结合到硅胶颗粒等固相物质上。随后使用洗涤液 70% 甲醇和丙酮进行若干次洗涤，硅胶颗粒等固相物质被干燥。在最后的步骤，核酸被洗脱液自硅胶颗粒等固相物质上洗脱。其结果是得到高纯度且高浓度的核酸，可以进一步用于随后的扩增、测序和其他的分子生物学检测分析。

第三章

气相色谱

1，色谱法：以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法称色谱法。2，固定相：管内保持固定、起分离作用的填充物。

流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。3，色谱法的特点： ①分离效率高

复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。

②灵敏度高

可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。③分析速度快

一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。④应用范围广

气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。

液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。⑤不足之处：

被分离组分的定性较为困难。

4，气相色谱法：是以惰性气体为流动相的柱色谱法 , 是一种物理化学分离、分析方法。5，色谱图：试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的信号——时间曲线或信号——流动相体积曲线，称为色谱流出曲线。

6，基线：无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。

峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高(peak height)。用h表示。

峰面积：峰与峰底之间的面积称为峰面积(peak area)，用A表示。7，保留值表示方法：时间表示和体积表示。

①保留时间：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间tR；

死时间：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间tM；

调整保留时间：tR＇= tR－tM

②保留体积：VR =tR×F0

F0为柱出口处的载气流量，单位：m L/ min。

死体积：VM = tM ×F0

调整保留体积：V R＇= VR－VM

8，相对保留值r21：组分2与组分1调整保留值之比（r21 = t´R2 / t´R1= V´R2 / V´R1 相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。

9，峰区域宽度表示方法：标准偏差，半峰宽和峰底宽。

标准偏差σ：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半；

半峰宽：色谱峰高一半处的宽度 Yh/2 =2.354σ

峰底宽：Wb=4σ 10，分配平衡参数：

①分配系数：在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相间达到分配平衡时的浓度比值，用大写K表示。

②容量因子：tR＇和tM之比即为容量因子（也称分配比或容量比），用小写k表示。它的物理意义是溶质分子消耗在固定相中的时间与消耗在流动相中的时间之比。11，色谱分离理论：

①塔板理论：将色谱柱比作一个分馏塔，在每个塔板高度间隔内，被测组分在气液两相间达到分配平衡。这个塔板高度称为理论塔板高度，以H表示。

有效塔板数计算公式：

tt Neff5.54(R)216(R)2 wh/2wb②速率理论：影响塔板高度的各种因素，可以用速率理论方程式（亦称Van Deemter方程式）表示。

③分离度：色谱柱总的分离效能可用分离度R（亦称分辨率）来评价。12，气相色谱固定相及其选择原则：

①相似相溶原理：“相似”是指溶质与溶剂在结构上相似；“相溶”是指溶质与溶剂彼此互溶。具体可以这样理解：

1．极性溶剂易溶解极性物质

2．非极性溶剂能溶解非极性物质

3．含有相同官能团的物质互溶，如水中含羟基（—OH）能溶解含有羟基的醇、酚、羧酸。

②选择固定液的原则：

1、根据相似性原则，被分离的组份为非极性物质时，应选用非极性固定液，组份流出色谱柱的先后顺序一般符合沸点规律，即低沸点先流出，高沸点后流出。若被分离的组分为极性物质时，应选用极性固定液，流出色谱柱的先后顺序符合极性规律，即极性弱先流出，极性强后流出。

2、对能形成氢键的物质，一般选择极性或氢键型固定液，流出顺序取决于组分与分子间形成氢键能力的大小。不易形成氢键的先流出。

③在分离极性和非极性混合物时，在理论上应该选择混合固定液。13，色谱柱的老化，以及为什么要老化：

①新色谱柱含有溶剂和高沸点物质，所以基线不稳，出现鬼峰和噪声；旧柱长时间未用，也存在同样问题。一般采用升温老化，即从室温程序升温到最高温度，并在高温段保持数小时。新柱老化时，最好不要连接检测器。

②每天都要进行老化吗？视仪器基线情况，确定是否需要老化以及老化时间。14，色谱柱分离效率评价：

①色谱柱效率：峰尖

评价：理论板高(H)、理论塔板数(N)；对策：将Van Deemter 各因素优化。

②选择性：峰的分离度

评价：分离因子或分离度；对策：选择极性相当的固定相。

③峰的对称性：吸附现象

评价：拖尾因子；对策：色谱柱进一步老化。

15，气相色谱分离条件的选择：

相色谱条件主要受载气种类、流速、柱温、汽化温度、柱长、柱内径、进样时间和进样量等因素影响。

根据范第姆特方程，流速是影响塔板高度的重要因素，通常选择稍高于最佳流速的载气流速；载气流速大时，应选择相对分子量小，扩散系数大的H2，Ne等作载气，反之选择相对分子量大，扩散系数小的N2，Ar等作载气；

提高柱温可以提高传质速率，提高柱效，但柱温过高又会使组分间分离度减小。采用较低的柱温，减少固定相的用量和适当增加载气的流速，可在短时间内获得良好的分离效果；

汽化温度应以能使试样迅速汽化而不产生分解为准，通常比柱温高20-70℃，柱温应比试样中各组分的平均沸点低20-30℃, 对于沸点范围较宽的试样，宜采用程序升温；

增加柱长会提高分离度，但分析时间增长，因此，一般在满足一定分离度的条件下尽可能用短柱子；

进样应在1秒以内完成，以减小峰变宽；

最大允许的进样量应该控制在使基线构成之面积称峰面积。A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064 Wh/2h>峰面积或峰高与进样量呈线性关系的范围内。16，色谱定性和定量分析方法：

①定性：

1.利用纯物质定性的方法

利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。

利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。

2.利用文献保留值定性

相对保留值r21：相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。

②定量：

1.测量峰高和峰面积；

2.定量分析的依据：在恒定的实验条件下，样品中组分的量(或浓度)与峰高或峰面积成正比。但，同一检测器对不同物质具有不同的响应灵敏度；

③常用方法：峰面积归一法；外标法；内标法。17，最高残留限量（MRLs）：原称允许残留量(tolerance level)，是指允许在动物性食品表面或内部残留药物的最高量或浓度。具体来说，是指在屠宰、加工、贮存和销售等特定时期，直到被人消费时，动物性食品中药物残留的最高允许量或浓度。一般用mg/kg表示。

18，残留标示物：用药后体内存在多个残留成分，则需要监控总残留物；总残留物在体内的各组分比例相对稳定，选择总残留物中1种或2种组分作为“参照物”，称为“残留标示物”；通过测定残留标示物的含量表示样品残留量和MRLs；选择残留标示物的原则：消除慢、含量高、稳定、毒性大。19，休药期（WDT）：是指畜禽停止给药到允许屠宰或它们的产品（乳、蛋）允许上市的间隔时间。WDT 可理解为从停止给药到保证所有食用组织中总残留浓度降至安全浓度，达到“最高残留限量”以下所需的时间。20，兽药残留分析技术特点：

①待测物质浓度低，浓度波动范围大； ②样品基质复杂，干扰物质多； ③兽药残留代谢产物多样或不明；

④动物种类多样，对药物代谢存在差异。

21，用色谱分析法建立兽药残留分析方法的基本步骤：

①文献检索

通过查阅文献，除掌握有关分析方法研究与应用的动态和存在的问题之外，还需要了解以下内容：待测物的理化性质，如极性、溶解性、酸碱性、稳定性、熔点或蒸汽压、波谱学性质等；体内代谢过程，包括代谢产物、组织分布、排泄途径和药动学性质（生物利用度、蛋白结合率等）；药理毒理学，如残留毒性、MRLs、WDT等。②建立样品处理方法

一般采用纯水作为样品基质进行预试，目的是了解液-液萃取（LLE）或固相萃取（SPE）条件、试剂干扰和回收率情况，然后再依次用空白样品和标准品添加样品进行研究。

HPLC测定中，溶解样品所用溶剂要与流动相互溶，最好与流动相接近，以免干扰色谱平衡，导致色谱峰变形或保留值改变。当RP-HPLC流动相中水的含量高于30%时，用纯甲醇和乙腈制备的终样品溶液进样会严重影响分离和峰形。③建立测定方法

多数兽药及其代谢产物属中等极性或较高极性化合物，不能直接进行GC（气相色谱）分离，HPLC是首选的测定方法，目前比较成熟和常用的检测器有紫外检测器（UVD）、荧光检测器（FLD）和电化学检测器（ECHD），对绝大多数兽药，反相（RP）HPLC是标准的分离方法，操作方便，易获得尖锐的峰形和良好分离。

根据待测物的极性或酸碱性，通过优化流动相的有机溶剂比例、pH、离子强度、离子对试剂和柱温达到分离目的。必要时可以改变反相色谱柱的类型，如C18、C8、交联聚苯乙烯等。

GC有许多灵敏的选择性和通用检测器供选择，如氢火焰离子化检测器（FID）、电子俘获检测器（ECD）、氮磷检测器（NPD）、火焰光度检测器（FPD）和液相层析质谱仪（MS），但大部分兽药需经过衍生化使极性降低后才能进行分析。④建立标准曲线

测定条件确定后，即可配制系列浓度的标准液制备标准曲线。至少设5个浓度，每个浓度水平设3次重复。制备标准曲线的浓度须涵盖样品可能的浓度范围，不进行外推计算。可以采用外标法或内标法定量。

残留样品浓度波动范围和测定误差较大，宜采用标准曲线或回归方程计算含量。在使用过程中需每日对标准曲线进行校正。⑤稳定性试验

一般包括标准溶液和样品在贮存条件下的稳定性试验，如室温、冷冻和反复冷冻—解冻条件下的稳定性。⑥分析方法评价

效能指标：精密度、准确度、灵敏度等。

一般采用标准添加样品进行，是研究建立新分析方法的重要组成部分和试验依据。一般至少设立3个浓度（10、1、0.1MRL），每个浓度水平设4次重复，经统计处理后可以同时获得各种效能指标。⑦分析方法报告主要包括以下内容：

（1）概述：分析方法发展现状及存在的问题。

（2）操作方法：稳定性试验方法，提取方法，净化方法，测定方法（分离方法、检测方法）。

（3）方法评价：标准曲线，回收率，变异系数，检测限，定量限，选择性。（4）应用

（5）附件：标准品、空白样品、添加样品和实测样品的色谱图，参考文献。⑧分析质量监控

分析方法经过认证和采用后在应用过程中需用标准样品对分析质量进行定期检查，以监测可能引入的任何新的系统误差。

绘制质量控制图是跟踪分析质量的常用方法。

22，精密度（precision）：指用某种方法重复测定同一均质样品所得测定值的彼此接近程度 ,表示分析结果的重复性。常用标准差(SD)或相对标准偏差(RSD)表示。RSD 又称为变异系数(coefficient of variation，CV)。

①重复性（repeatability）：指在短期内相同的实验条件下(实验室、操作者、仪器型号和试剂批号)对同一样品测定结果间的精密度。

②重现性（reproducibility）：指不同实验条件下(不同实验室、不同操作者、不同仪器型号和试剂批号)使用某种分析方法对同一样品各个独立测定值间的精密度。准确度(accuracy)：准确度指测定值(平均值)与真实值的接近程度 , 表示分析结果的正确性。

回收率(recovery)：回收率=(测定值一空白值)/添加量检测限(LOD)：指分析方法能够从样品的背景信号中检测出待测物存在时所需的最低浓度。

定量限(LOQ)：指分析方法能够对样品中待测物进行定量测定的最低浓度。

23，线性范围(linear range)：是待测物浓度与仪器的响应信号(如峰高或峰面积)呈线性关系并且能满足定量(精密度和准确度)要求的浓度范围，用浓度最小值和最大值或二者之比表示。

24，动态范围（dynamic range）：为检测器响应信号随待测物浓度增加的浓度范围。25，选择性（selectivity）：指样品基质中有其他组分共存时该分析法对待测物的分辨能力。26，检测器性能评价指标：

①响应值（灵敏度）：在一定范围内，信号E与进入检测器的物质质量m呈线性关系：S表示单位质量的物质通过检测器时，产生的响应信号的大小。S值越大，检测器（也即色谱仪）的灵敏度也就越高。②最低检测限（最小检测量）：噪声水平决定着能被检测到的浓度（或质量）。检测器响应值为2倍噪声水平时的试样浓度（或质量），被定义为最低检测限（或该物质的最小检测量）。③检测器的线性度（线性范围）：是待测物浓度与仪器的响应信号(如峰高或峰面积)呈线性关系并且能满足定量(精密度和准确度)要求的浓度范围 , 用浓度最小值和最大值或二者之比表示。

27，检测器响应指标：

①灵敏度：单位含量样品的响应，即响应值与含量构成的直线的斜率。直线的最小值定义为最低检测限(MDL)。

②选择性：衡量检测器对某些类型化合物是否有响应。③动态范围：检测器提供的能正确定量的样品浓度范围。28，氢火焰离子检测器（FID）： 29，热导检测器（TCD）： 30，电子捕获检测器（ECD）： 31，分流进样技术特点：

①在高分流比下(>100:1)，样品中起始组分的谱带扩展很小，出峰尖锐；

②操作方便，能根据所分析样品的体积和浓度很容易调节分流比值；

③在恒温和程序升温操作时，结果的重复性都很好，一般峰面积的相对标准偏差在0.2%~2%；

④当分析的样品组分浓度范围和沸点范围较宽时，容易产生分流失真，浓度低和沸点高的组分，样品回收率低，精密度也差； ⑤不适于痕量分析；

⑥载气消耗量大，特别在高分流比时；

⑦定量分析的精密度和准确度，依赖于进样的重复性和操作技巧。

32，Grob无分流进样：是建立在低温浓集技术利用溶剂效应的原理基础上，使样品组分的谱带变窄而溶剂又不脱尾的进样技术。33，气相色谱日常维护要点：

①环境环境温度应在+5~+350C相对湿度

②室内应无腐蚀性气体，离仪器及气瓶3m以内不得有电炉和火种。

③室内不应有足以影响放大器和记录仪（或色谱工作站）正常工作的强磁场和放射源。④电网电源应为220V（进口仪器必须根据说明书的要求提供合适的电压），电源电压的变化应在5%~10%范围内，电网电压的瞬间波动不得超过5V。电频率的变化不得超过50Hz的1%（进口仪器必须根据说明书的要求提供合适的电频率）。采用稳压器时，其功率必须大于使用功率的1.5倍。

⑤仪器应平放在稳定可靠的工作台上，周围不得有强震动源及放射源，工作台应有1m以上的空间位置。

⑥有的气相色谱仪要求有良好的接地，接地电阻必须满足说明书的要求。⑦气源采用气瓶时，气瓶不宜放在室内，放室外必须防太阳直射和雨淋。

34，色谱柱的维护要点：①正确安装色谱柱；②正确老化色谱柱；③避免色谱柱热损坏。35，无分流进样技术中常见问题及处理措施：

①宽峰

宽峰是由于在洗脱开始之前使用了不恰当的混合溶剂进入到柱头，产生了窄的剖面而引起的。如果宽峰在溶剂峰附近，那么利用溶剂聚焦可以改善它们，即较低起始柱温的保持时间应等于进样时间。如果后洗脱峰变宽或被分裂，可以怀疑是浸渍效应，使起始柱温度低于溶剂沸点 20 ℃，进样体积小于 1 μL。如果这种峰分裂现象消失，说明发生了浸渍效应。将色谱柱前接一段较大口径(0.32~0.53mm)、长 0.5~lm 的未涂任何固定相的预柱，则可解决这个问题。②重复性差

在无分流进样时，结果的标准偏差过大，可能由于多种原因引起，无分流进样器自身设计的缺陷是造成这种情况的主要原因。在这种情况下采用冷柱器头进样或PTV 进样技术是最好的解决方案。

另外也可能是由于选用了不适当的进样条件。例如，进样时间过短会造成重复性差，柱流量至少确保为1mL/min(最好更大些)；进样体积过大也会造成重复性差、峰拖尾和鬼峰等现象，解决办法是改进方法检测限，减少进样体积；此外，应检查峰的积分是否正确，在检测限附近的峰每次运行的偏差都比较大。不同浓度样品积分参数设置应该不一样，要检查基线和峰的积分起点和结尾点。36:，分流进样技术中样品失真问题的处理措施：

①分流比

对于浓度较低的样品，应选择较小的分流比；对于浓度较大的样品，应选择较大的分流比。一般常用（50 : 1）~（200:1）的分流比。②进样器的温度

分流进样器的温度应接近于样品中沸点最高组分的沸点温度。特别在分流比较低时，进样器的温度低对样品组分的失真影响更大。当分析热不稳定的样品时，不能使用较高的进样器温度，可以用提高分流比的办法来减少样品组分失真程度。③样品与载气必须充分混合样品注入气化室后，必须进行充分混合，否则，样品组分失真必然增大。使样品和载气在气化室中达到充分均匀混合可以在气化室内松散地填充玻璃或石英棉，使样品和载气在气化室内产生局部的涡流而得到充分的混合，填充物也同时提高了气化室的热容，有利于样品的瞬间气化，同时也可得到良好的线性分流。④载气流量的大小

增大总的载气流量以减小样品在气化室内的停留时间，可减小样品峰在进样器内的扩展。但载气流动快，致使样品蒸发不完全，也容易造成分流失真。系统内特别是柱内载气流速的波动是造成色谱峰保留值不重复的主要原因。选择恒流操作方式要优于恒压操作方式。⑤进样体积应精确重复

每次进样体积必须精确重复，因为进样体积不同会引起气化室内蒸气压力的波动，从而改变分流比。⑥进针应快速进行

进针速度快可以减小原始谱带扩展和针头歧视效应。⑦柱温的选择

柱温或程序升温中的柱子初温必须适当选择，该温度最好接近或甚至低于样品中主要成分或溶剂的沸点，将使进入柱头的部分蒸汽凝聚，形成一个低压区，将吸引更多的蒸汽流入柱内，从而减少预置的分流比。

第四章

气相色谱-质谱联用分析技术 1，GC-MS基本结构和工作原理： 2，GC-MS对气相色谱仪的要求：

①色谱柱的选择：应尽量避免高温时色谱柱固定液的流失问题。为此，应采用耐高温的色谱柱固定相，或采用键合型固定相，此外，还可以在柱后加一个流失吸附柱。另外，GC-MS中所选择色谱柱的长度和内径应与接口相匹配。

②载气的选择：载气应具有化学惰性、不干扰质谱图、能使载气中样品富集和不干扰总离子流检测、纯度高（＞99.995%）的特点。3，质谱仪的基本结构和工作原理：

①基本结构：由进样系统、离子源、质量分析器、离子检测器以及维持质谱仪正常工作所需要的真空系统组成。

②工作原理：样品组分经过气相色谱柱分离，然后进入质谱仪。在质谱仪中，有机分子在高真空下，受电子流轰击或强电场作用，离解成各种具特征质量的碎片离子和分子离子。这些具有不同质荷比的离子，在磁场中被分离。收集、记录这些离子的信号及强度，便可得到各组分的质谱图。在质谱图中，横坐标表示质荷比，纵坐标表示离子丰度，根据该图可进行谱库检索，即获得有关相对分子质量与结构方面的特征信息。4，电子轰击电离源（EI）：是应用最为广泛的一种离子源，它利用具有一定能量的电子束在真空中与气态的中性样品分子或原子进行非弹性碰撞，使分子或原子电离成正负离子。5，EI的主要特点：

①能电离气体、挥发性化合物和金属蒸气；

②结构简单、电离效率高、控温方便、操作方便、性能稳定，所得的质谱图是特征的； ③现已发展为采用惰性金属材料设计的离子源，可大大地提高离子源抗污能力，降低其清洗频率。

6，化学电离源（±CI）：是一种常用的“软”电离源，它是使有机化合物样品分子和反应气体（或反应试剂）离子之间发生分子-离子反应，而使样品分子电离的方法。常用的反应气体有甲烷、异丁烷、氨等。

7，EI/±CI复合源：两种电离源混合在一起使用，可以降低成本，一次分析可以同时得到EI和±CI图谱，但不能使二者都达到最优，因为二者的电离原理和离子源的设计不同。8，质量分析器作用？常用的质量分析器？

①作用：把具有不同质荷比的来自离子源的离子束依其质荷比大小顺序分别聚焦和分辨开，以便得到按质荷比大小顺序排列而成的质谱图，一般是利用电磁场对电荷的偏转性质来实现质量色散的。

②常用的：磁质量分析器、四级杆质量分析器、离子阱质量分析器、飞行时间质量分析器、离子回旋共振质量分析器和串联质量分析器。9，离子流检测器的作用？ 10，为什么MS需要高真空？

①提供足够的平均自由程； ②提供无碰撞的离子轨道； ③减少离子-分子反应； ④减少背景干扰； ⑤延长灯丝寿命； ⑥消除放电； ⑦增加灵敏度；

⑧真空系统确保离子由离子源转移至检测器。11，GC-MS工作模式：

①全扫描工作模式（SCAN）：经离子源生成的碎片离子混合物进入质量分析器后，将按照原子质量单位或质荷比设定的质量范围从大到小完成一次扫描。一次扫描完成之后，系统复位，开始下一轮的扫描。②选择离子监测模式（SIM）：质谱仪只监测若干个离子。由于监测的离子数少，在相同扫描周期内，用以监测每个离子的时间比Scan模式的时间长。所以Sim模式比Scan模式灵敏度提高5~100倍。因此，Sim模式在检测混合物中微量的已知化合物是非常有用的。Sim模式对精度高的定量分析可给出很好的重复性结果。

12，GC-MS主要评价指标：①分辨率（仪器将两个相邻的质谱峰区别开的能力）；②质量范围（能测量质谱的最大质量数离子和最小质量数离子之间的质量数范围）；③灵敏度（在规定的分辨率和信噪比下，由气相色谱仪进样，质谱仪能给出定性质谱的最小样品质量）；④扫描速率（是分辨率和频率响应的函数）。13，GC-MS分析计算方法： 14，GC-MS操作维护要点：

①了解待测样品的含量，尽量减少进样量。如果全部未知，最好先摸清色谱条件； ②避免用大口径柱和厚液膜柱；

③用检测性能的标样PFTBA检查系统性能；

④定期进行预防性保养，减少维修次数，并注意保存仪器的维护档案。

第五章

高效液相色谱

1，HPLC法的概念：特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。

2，液相色谱概念：以液体作为流动相的色谱分离方法。3，HPLC与GC的差别： ①分析对象的区别

GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测。占有机物的20%；

HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测。用途广泛，占有机物的80%。②流动相差别的区别

GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用，只与固定相有相互作用； HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。③操作条件差别

GC：加温操作；

HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）

4，HPLC的特点和实际应用有哪些： ①利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂体系中的痕量组分。

正相色谱分离有机溶剂中的物质，反相色谱分离水溶液中的物质----生化物质。

②用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对色谱法分析离子型体的含量。蛋白质、氨基酸、常见阴阳离子等）

③利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分离高分子化合物。④利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化合物。5，HPLC流动相选择注意事项：

①纯度高：采用“ HPLC ”级溶剂；②避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂；③对试样有适宜的溶解度；④溶剂黏度要小；⑤溶剂沸点要高于 55 ℃；⑥溶剂与检测器相匹配；⑦化学稳定性好；⑧溶剂要能完全浸润固定相；⑨流动相配制时的顺序。6，等度洗脱和梯度洗脱： ①等度洗脱：

②梯度洗脱：又称溶剂程序，是指在分离过程中，随时间函数程序地改变流动相组成，即程序地改变流动相的强度（极性、pH 或离子强度等）。通过梯度装置将两种或三种、四种溶剂按一定比例混合进行二元或三元、四元梯度洗脱。7，HPLC检测器常用评价指标：

①响应值检测器的响应值 R=ΔS/ΔA，其中 ΔS 指对于一定量的溶质ΔA通过检测器时所引起检测器输出信号的变化，也称为灵敏度(sensitivity)。

②最小检测量：最小检测量(检测限，detectability)是指某一样品的最小进样量，该进样量能够得到相当于仪器噪声2倍的信号值。

③线性范围(linear range)：是指检测器对于某个样品从小到大的不同进样量，其响应值与进样量之间保持线性关系的范围，以呈线性响应的样品量上、下限之比来表示。一般要求检测器的线性响应范围宽一些为佳。

④噪声：是指由仪器的电器元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的无规则波动。噪声的存在会降低检测灵敏度，严重时使仪器无法工作。

⑤漂移：是指基线随时间的增加朝单一方向的偏离。

⑥池体积：检测器的池体积应小于最早流出的死时间色谱峰的洗脱体积的 1/10，否则会产生严重的柱外谱带扩展。8，紫外吸收检测器（UV）：是按照光吸收的基本定律比尔-朗伯(Beer--Lambert)定律设计的，它是 HPLC 最基本的一种检测器，仅对那些在紫外、可见波长下有吸收的物质有响应。

9，二极管阵列检测器（DAD）：可以记录 190~800nm 波长吸收光谱数据。光线先通过样品池再进行光栅分光，发射至位于硅片上阵列的发光二极管形成光谱。10，荧光检测器（FD）：是利用某些溶质在受紫外光激发后，能发射可见光(荧光)的性质来进行检测的，属于选择性浓度检测器。流动吸收池的体积一般只有 5~10 μL，光程长1cm左右。

11，示差折光检测器（DRD）：是浓度型检测器，它通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定试样浓度，是一种通用型检测器。但只对少数类别物质的检测灵敏度较高，对多数物质灵敏度较低。12，蒸发光散射检测器（ELSD）：通用检测器，其原理是将从色谱柱流出的流动相及组分引入已通气体的雾化室，样品组分在雾化气体作用下形成气溶胶，在漂移管末端，只含溶质的微小颗粒在强光照射下产生光散射，用光电倍增管检测到散射光与组分的量成正比。

13，电化学检测器（ECD）：包括电导检测器、安培检测器和极谱检测器等。14，化学发光检测器（CLD）：设备简单，不需光源，价格便宜。其原理是将被分离的组分流出色谱柱后与发光试剂混合，产生化学发光反应，其光强度与该组分的浓度成正比。15，HPLC主要分离模式：

①液液分配色谱法； ②液固吸附色谱法； ③离子交换色谱法； ④空间排阻色谱法； ⑤亲和色谱法。

16，液相分配色谱法：流动相和固定相都是液体，因试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，而在两相间进行不同分配得以分离的方法。

①正相色谱法（NPC）：流动相极性小于固定相极性；

②反相色谱法（RPC）：流动相极性大于固定相极性；

③离子对色谱法：在固定相上涂渍或流动相中加入与溶质分子电荷相反的离子对试剂，来分离离子型或可离子化的化合物的方法。

17，液固吸附色谱法（LAC）：流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据吸附作用不同而进行分离。18，离子交换色谱法（IEC）：以离子交换剂为固定相，借助于试样中电离组分对离子交换剂亲和力的不同以达到分离离子型或可离子化的化合物的目的。19，空间排阻色谱法（SEC）：也称为立体排阻色谱或凝胶色谱(gel chromatography)，是基于分子大小不同而进行分离的一种色谱技术。20:，亲和色谱法（AC）：是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂生物样品中分离和分析特殊物质的一种色谱方法。21，使用色谱柱注意事项：

①避免机械震动，对于小颗粒填料，更应避免柱的震动，以保护柱床。流动相的流速应逐渐增加。

②应逐渐改变溶剂的组成，特别是在反相色谱中不应直接从有机溶剂改变成全部是水，反之亦然。

③使用过缓冲液和盐溶液的流动相后，必须用 5% 的甲醇水洗净，最后储存在有机溶剂中而不是水中，反相色谱柱通常用甲醇保存。④样液一般在进样前一定要过滤或高速离心，即使这样处理，色谱柱使用到一定时间后，柱压也会因为柱头堵塞而升高。在这种情况下，可以取下柱头，放在 50% 硝酸或丙酮中超声处理。如柱头处固定相太脏，也可挖出少许，再小心填上新的填料(填料加乙醇调成糊状补于柱头并压紧)，但这样处理次数不宜太多。⑤组分不能从柱中洗脱出来的问题常发生在柱头，这会引起峰的拖尾和峰的分叉，可用低流速倒洗柱的方法将这些物质洗出，但需注意的是柱倒向使用后，柱效会降低。22，色谱柱的储存要求：

通常实验后反相柱应用甲醇冲洗，尤其是在用过含有盐的流动相后，必须先用大量含有5%甲醇的水溶液冲洗干净(由于纯水极性强，无法润湿现在很多高碳覆盖率的低极性固定相，为避免色谱柱出现疏水塌陷，故反相柱一般不采用纯水冲洗，而大多使用含有5%甲醇的水冲洗)，再换上甲醇冲洗。

对复杂的生物样品，有些组分不能从柱中洗出，最后一定要用甲醇洗出。若每天都用于相同的分析，暂时不做时也可用小流速(0.1mL/min)的流动相通过柱子。若将色谱柱从仪器上取下保存时，必须洗去柱中所有的盐，并用甲醇冲洗干净，储存在甲醇中避免细菌生长。柱子两端应塞紧以免溶剂挥发。正相柱常储存在正己烷中，对新用的柱子或储存过的柱子，用前都应测定它的柱效，如理论塔板数和拖尾因子等。

第六章

液相色谱-质谱联用技术 1，液质联用与气质联用的区别：

①GC-MS是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式得到的谱图，可与标准谱库对比。

②LC-MS主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。

2，质谱原理：质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标离子质荷比为横坐标所作的条状图就是我们常见的质谱图。3，质荷比：离子质量与它所带电荷的比值。

峰：质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰。

离子丰度：检测器检测到的离子信号强度。

基峰：在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰。4，总离子流图(TIC)：在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图。

5，质量色谱图：指定某一质量的离子强度对时间所作的图。

6，准分子离子：指与分子存在简单关系的离子，通过它可以确定分子量。7，碎片离子：准分子离子经过一级或多级裂解生成的产物离子。

8，多电荷离子：指带有两个或多个电荷的离子，常见于蛋白质或多肽等离子。9，同位素离子：由元素的重同位素构成的离子。10，如何看质谱图：

①确定分子离子，即确定分子量；

②确定元素组成，即确定分子式或碎片化学式； ③分析确定峰强度与结构的关系。11，质谱解析的一般步骤：

①核对获得的谱图，扣除本底等因素引起的失真，考虑操作条件是否适当；

②综合样品其他知识；

③尽可能判断出分子还是离子； ④假设和排列可能的结构归属；

⑤假设一个分子结构，与已知参考谱图对照，或取类似的化合物，并作出它的质谱进行对比。

12，有机质谱的特点：

①优点：确定分子量准确，其它技术无法比；灵敏度高；快速；便于混合物分析；多功能，广泛适用于各类化合物。

②缺点：异构体，立体化学方面区分能力差；重复性稍差，要严格控制操作条件；有离子源产生的记忆效应，污染等问题；价格稍显昂贵，操作有点复杂。13，LC-MS的基本结构和特点：

①组成：液相色谱仪、接口、质量分析器、检测器。

②特点：解决GC-MS难以解决的问题；利于从分子水平上研究生命科学；解决液相色谱分离组分的定性、定量能力；增强液相色谱的分离能力；提高液相色谱的检测限；通用型检测器。

14，LC-MS进样技术：直接进样；流动注射；液相色谱进样。15，LC-MS的接口：

①移动带接口：

②热喷雾接口： ③TS离子束接口： ④电喷雾电离接口：

⑤大气压化学电离源接口：

16，电喷雾与大气压化学电离的比较：

①电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是高压放电发生了质子转移而生成[M+H]+或[M-H]-离子；

②样品流速：APCI源可从0.2~2ml/min；而电喷雾源允许流量相对较小，一般为0.2~1ml/min；

③断裂程度：APCI源的探头处于高温，对热不稳定的化合物就足以使其分解；

④灵敏度：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更适合于分析极性较小的化合物； ⑤多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子。17，质量分析器：

①飞行时间质量分析器（TOF）：

②串联质谱： ③碰撞诱导解离： 18，LC-MS操作要点： 19，LC-MS的优化技术：

①离子源选择：

②正、负离子模式选择： ③流动相选择： ④温度选择：

⑤质谱扫描方式选择： ⑥系统背景的清除：

20，影响分子量测定的因素：pH的影响；气流和温度；溶剂和缓冲液流量；溶剂和缓冲液的类型；选择合适的液相色谱类型；选择合适的电压；注意样品结构和性质；杂质的影响；样品浓度不够，有时候需要进一步浓缩。

21，分子量测定中的误判原因：溶剂中的杂质；来自于塑料添加剂的峰；样品容器不干净，常见表面活性剂的峰；进样系统污染；样品在源内碎裂，形成碎片离子。

22，分子量测定失败的原因：流动相不合适；不挥发性盐的影响；成分复杂，杂质太多；样品浓度不够；pH值不合适；样品在源内分解或碎裂。

第七章

原子吸收光谱技术（AAS）1，原子吸收光谱法（AAS）：是基于从光源辐射出具有待测元素特征谱线的光，通过试样蒸气时被蒸气中待测元素基态原子所吸收，蒸气相中被测元素的基态原子对其原子共振辐射的吸收强度（特征谱线的光减弱的程度）来测定试样中被测元素含量的分析方法。2，AAS分析特点：

①灵敏度高、检出限低； ②选择性好、抗干扰能力强； ③分析速度快； ④精密度好； ⑤应用范围广；

⑥分析不同元素，必须使用不同元素灯； ⑦操作简便，易于掌握。

3，AAS基本原理：当有辐射通过自由原子（如镁、铜原子）蒸气，且入射辐射的频率等于原子中的电子由基态跃迁到较高能态所需要的能量频率时，原子就要从辐射场中吸收能量，产生吸收，电子由基态跃迁到激发态，同时伴随着原子吸收光谱的产生。（如镁原子吸收285.2nm、279.6nm的光，铜原子吸收324.8nm、327.4nm的光）。4，共振吸收线：当电子吸收一定能量从基态跃迁到能量最低的激发态时所产生的吸收谱线。

共振发射线：当电子从第一激发态跃回基态时，则发射出同样频率的光辐射。

分析线：用于原子吸收分析的特征波长的辐射称为分析线。5，谱线变宽：

①自然变宽：谱线本身固有的宽度称为自然宽度，与激发态原子的平均寿命有关，平均寿命越长，则谱线宽度越窄，一般约10-5nm。它与谱线的其它变宽宽度相比，可以忽略不计。

②多普勒变宽：多普勒变宽是由于原子在空间作无规则热运动而引起的，所以又称热变宽。它是谱线变宽的主要因素。

6，积分吸收：在一定条件下，基态原子数N0正比于吸收曲线下面所包围的整个面积。

峰值吸收：基态原子蒸气对入射光中心频率线的吸收。峰值吸收的大小以峰值吸收系数K0表示。由于在目前的技术条件下无法测量积分吸收，可以用峰值吸收代替积分吸收。7，峰值吸收测量条件：光源发射线的半宽度应小于吸收线的半宽度，且通过原子蒸气的发射线的中心频率恰好与吸收线的中心频率ν0相重合。因此在选择光源时不能采用钨灯、氘灯等连续光源，而应采用空心阴极灯，无极放电灯等线光源。8，AAS与UV-ViS的比较：

①相同点：均属于吸收光谱分析；均服从光吸收定律。

②不同点：原子吸收光谱分析的吸收物质是基态原子蒸气；紫外-可见分光光度分析的吸光物质是溶液中的分子或离子；原子吸收光谱是线状光谱，紫外-可见吸收光谱是带状光谱。

9，原子吸收光谱定量分析的基础：

①原子吸收光谱是利用待测元素的原子蒸气中基态原子与特征谱线吸收之间的关系来测定的。

②只要测量吸收前后发射线强度的变化，便可求出被测元素的含量。

③当吸收厚度一定，在一定的工作条件下，峰值吸收测量的吸光度与被测元素的含量成正比。

10，AAS基本工作原理：通过含有被测元素的光源、发射一组特征谱线，再将被样品溶液中的被测元素在原子化器中原子化，原子化了的被测元素自由原子与这组特征光谱产生共振吸收，通过光学系统、单色器、检测器，能测量出自由原子对特征光谱的吸收程度，从而检测出被测样品中被测元素的含量。11，AAS分析的基本过程：

①将样品制备成溶液形态；

②制备一个不含被分析元素的溶液(空白);

③制备一系列己知浓度的被分析元素的校正溶液(标样);

④依次测出空白及标样的响应值；

⑤依据上述相应值绘出校正曲线;

⑥测出未知样品的响应值;

⑦依据校正曲线及未知样品的响应值得出样品中相应组分的浓度值。12，原子化的四个过程：干燥、灰化（去除基体）、原子化、净化（去除残渣），待测元素在高温下生成基态原子，即完成一次分析过程。13，原子吸收定量分析方法：

①标准曲线法：配制一组含有不同浓度被测元素的标准溶液，在与试样测定完全相同的条件下，按浓度由低到高的顺序测定吸光度值。绘制吸光度对浓度的校准曲线。测定试样的吸光度，从校准曲线上用内插法求出被测元素的含量。

②标准加入法：分取几份相同量的被测试液，分别加入不同量的被测元素的标准溶液，其中一份不加被测元素的标准溶液，最后稀释至相同体积，使加入的标准溶液浓度为0，C0、2C0、3C0、4C0 „，然后分别测定它们的吸光度，绘制吸光度对浓度的校准曲线，再将该曲线外推至与浓度轴相交。交点至坐标原点的距离Cx 即是被测元素经稀释后的浓度。

14，原子吸收定量分析的干扰因素：物理干扰、化学干扰、光谱干扰、电离干扰、和背景干扰等。

15，原子吸收测定条件： ①分析线的选择

每种元素都有若干条吸收线，常选择最灵敏的共振线进行分析。在分析被测元素浓度较高试样时，可选用灵敏度较低的非共振线作为分析线。②空心阴极灯电流选择

应在保持稳定和有合适的光强输出的情况下，尽量选用较低的工作电流。③火焰类型和燃烧器高度的选择

燃气、助燃气和燃烧器高度三因素的选择用正交试验的方法来综合选择最佳水平。④狭缝宽度的选择 ⑤进行回收试验

在选定条件下做标准加入回收试验，确定试样中的其它组分有无干扰，以便控制和消除干扰。

16，灵敏度的影响因素：

①待测元素本身的性质

如难熔元素的灵敏度比普通元素灵敏度要低得多。

②测定仪器的性能

如单色器的分辨率、光源的特性、检测器的灵敏度等有关。

③实验因素的影响