仪器总结_仪器室总结
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※激光共聚焦显微镜技术（Confocal Lasers Scanning Miccruscope CLSM)是将显微镜技术与激光技术有效的结合，对具有荧光标记的物的形态及功能，通过计算机控制可以对其单层面进行快速扫描，也可以对多个层面进行连续光片层扫描。逐层获得二维光学横断面图像，并可通过计算机三维重组软件支持，获得真三维图像。
其主要※优点为：以激光为光源，在相应的荧光探针标记后，对样本进行逐点扫描，逐层获得二维光学横断面图像，具有“细胞CT”的功能，并可通过计算机三维重建软件支持，获得真三维图像，并可以任意角度旋转，观察细胞，组织的立体形态和空间关系；可以对活细胞和组织进行无损伤的观察，动态测量细胞内的Ca离子浓度和pH值等活细胞生理信息；可对细胞膜的流动性，细胞间通讯，细胞融合，细胞骨架弹性测量等，可用作“光刀子”完成细胞内“外科手术”。这一技术使得对活细胞和组织进行原位，动态，定量的观察和测量的梦想成为现实。※荧光探针：在生物染色剂当中有一种能被紫外线或蓝紫光激发而发射荧光的染料，称为荧光素。现在一些荧光素也可以被长波光激发，将这些荧光素称为荧光探针。※什么是荧光？
物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出长波光。• 物质的荧光有两种：原发荧光（自然荧光、固有荧光、自发荧光）；诱发荧光（继发荧光）。
※荧光探针的性质及特点
1、激发波长和发射波长
2、荧光强度
3、荧光寿命
4、光稳定性
5、染料分子之间的相互作用
6、染料分子对环境的敏感性。
2、用于激光共聚焦测定的荧光样品的制备一组织和细胞样品中荧光的来源：
1、利用激光共聚焦显微镜观察的样品的种类繁多，在生命科学中的研究包括生物材料、组织、细胞等。※
2、组织和细胞样品中荧光的来源：
1、自发荧光
2、荧光染色
3、免疫荧光
4、外源性荧光物质进入组织、细胞内产生的荧光
5、诱发荧光
6、酶至荧光。
※荧光探针分子与核酸的结合基本有三种方式：1 嵌入性结合方式；2 结构亲和方式；3 以共价键方式结合。
• 碘化丙啶（Propidium Iodide PI)（红色）：PI检测核酸、标记细胞
Hoechest33342、Hoechest33258和DAPI（4’.6-diamidino-2-phenylindole)（蓝色）：检测核酸、标记细胞
丫啶橙（Acnidine orange AO)（橙色）：丫啶橙检测DNA和RNA AO标记细胞的方法：
（1）细胞涂片→固定→醋酸酸化→ AO染色5-10min →分化→洗涤→上机；
（2）活细胞标记，AO本身具有一定的跨膜能力，直接用0.01％AO标记细胞5min后，直接观察。
组织形态学观察 组织样本的制备与标记
新鲜的组织标本
新鲜组织标本取材（3ｍｍ－5ｍｍ）
ＯＣＴ包埋剂覆盖，铝箔膜包裹，浸入液氮（组织标本的厚约2ｍｍ）`
恒冷切片机切片（厚度4-6μｍ）
固定的组织标本
• 组织固定4-6小时后取出
ＰＢＳ冲洗 30﹪蔗糖沉淀
恒冷切片机切片（厚度4-6μｍ）
石蜡固定的组织标本 石蜡切片机切片4-6μｍ
※ 薄层扫描法是薄层色谱扫描法或薄层色谱扫描光密度法的简称，相应仪器称为薄层色谱扫描仪（简称薄层扫描仪）。它是色谱法的一部分。
※ 其基本原理和过程如下： 它是把吸附剂或支持剂涂于玻璃板或其他载体上形成薄板，将待分离的样品溶液点在薄板的一端，在密闭容器*中用适宜的溶剂展开而形成样品组分斑点来进行色谱分析。如：凝胶电泳。※ 定义：通常薄层扫描法指薄层斑点的色谱和光谱扫描两大类扫描方式。一般用狭义的定义来描述薄层扫描法。※用一定波长的光束照射展开后的薄层板，测定薄层色谱斑点的吸光度A（或荧光强度F）随展开距离L的变化，所记录的A-L（或F-L）曲线称为薄层色谱扫描图，简称薄层扫描图，用此图进行定量、定性分析*的方法称为薄层扫描法
（即薄层色谱扫描法）。
※ 色谱扫描主要分为两大类：
薄层吸收扫描法；
薄层荧光扫描法 Ⅱ.光谱扫描
定义：测定色谱斑点光谱的扫描方法称为光谱扫描*。
※ 与色谱扫描的区别： 光谱扫描：斑点固定，波长改变，测A-λ曲线（吸收光谱曲线或吸光度-波长曲线）。色谱扫描：斑点改变，波长固定，测A-L曲线（吸光度-距离曲线）。
※ 薄层扫描仪的基本结构: 薄层扫描仪依据制造厂家的不同其基本结构各有差异。从检测方式来看有单、双光束之分，扫描方式亦有单、双波长扫描的区别，但是无论那种仪器，它的基本结构大体可分五部分：光源、单色器、样品台、检测器和打印记录等五部分组成。
※ 光源部分→可见光或紫外线→单色光部分→单色光→样品部分→反射光、透射光→检测器部分→检测信号→记录器部分
※薄层色谱的一般分离技术：薄层扫描法是一种色谱分离分析方法，要进行定量分析，必须先进行色谱分离，现介绍有关的分离技术。
※薄层色谱分类及分离机制： 薄层色谱法从本质上讲也是一种液相色谱法，它是将作为
固定相的吸附剂或支持剂涂布于支持板上而进行的色谱分离，根据所涂的吸附剂及作用机理的不同可分为吸附、分配、离子交换和空间排斥等四类薄层色谱。
※ 吸附色谱：分离机制是利用吸附剂对于样品中各组分的吸附能力的不同，产生迁移速度的差别而分离。
※ 薄层色谱法的应用: 医学和制药：
进行天然和合成药物的质量控制，药物代谢的研究。可分析解热镇痛剂，感冒剂，催眠剂，磺胺类药剂镇静剂，抗组织胺，局部麻醉剂，麻药，抗生素，强心剂，类脂，类固醇，生物碱，生药等。
药物和临床化学： 进行生物体内痕量物质的检出和定量测定。可分析类固醇激素，胆汁醇，类固醇生物碱，强心剂，吲哚衍生物，生物碱，天然类脂，脂肪酸，胆汁酸，甘油酯，胆汁醇脂，脂肪酸脂，芳香醇，芳香醛，络合类脂，水溶性维生素，脂溶性维生素等。
生物化学： 天然物和生物体内物质的检测及定量测定。可分析生物碱，天然酚，类脂，氨基酸，肽酸氨酸，核酸，糖等。食品和化妆品： 进行各种组分的定量测定。可分析氨基酸，核酸及其他有关物质，食品添加剂，化妆品组分等。
农药： 进行农药合成的研究，杀虫剂残留量的定量测定。可分析有机磷类农药，有机氯类农药，有机汞类农药。各种杀虫剂，除草剂，菊酯类农药等。
环境及食品污染： 用于空气，水和食品污染等的研究和监测。可分析多环芳族化合物。例如3.4-苯并芘，黄曲霉素（来自霉菌的致癌物质），食品添加剂等。
有机和无机化合物： 可用于合成研究。能分析醇，酚，醛，酮，羧酸，胺，烯烃，金属离子，阴离子，络合物等。
※ Ct值: 从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。或是指每个反应管内的荧光
信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
C代表循环(Cycle)，T代表阈值.（Threshold）.CT值必须位于指数增长阶段内.※ 荧光定量PCR原理包括: 一．定量PCR的数学原理;二．定量PCR的化学原理;三．定量PCR的光学原理;四．多重荧光定量;五．等位基因鉴定。
※ 1.Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。※ 2.荧光域值（threshold）：是指 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号，荧光域值的缺省设置
是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。
※ 3.Ct 值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线
性关系〔 1 〕，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代 Ct 值（如图 2 所示）。因此，只要获得未知样 品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
※ 什么是阈值？
1、基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。
2、偶然误差的结果满足对数分布。
3、阈值=基线（背景）信号标准偏差x10.4、由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于10-5（10的-5次方）。
5、当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR得扩增使得荧光强度得以测量。※离心机转速表示方法：为方便起见，F常用相对离心力也就是地心引力的倍数表示。即把F值除以重力加速度g(约等于9.8m/s.)得到离心力是重力的多少倍，称作多少个g。因此，离心力F不仅和转速r/min有关系，还和半径有关。同样的转速，半径大一倍，离心力(g值)也大一倍。
转头：分为(1)水平转头也称吊篮式转头。(2)角转头(3)区带转头(4)分析转头。• ※样品的装载和平衡：（1）由于离心时产生很大的离心力。当转头所带的样品处于不平衡状态时，会产生很大的力矩。轻者引起机器发抖和震动，重者会扭断转轴造成事故。因此离心样品的平衡装载是特别要注意的问题。（2）离心转速越高，对平衡的要求也越高。如超速离心机不仅要求在对称位置的离心管一样重，吊篮一样重，而且吊篮还有编号，需对号放置。在平衡时不仅要保证静平衡，即对称的两管样品等重，还要保证动平衡。
