核酸抽提经验及原理总结_核酸提取原理及方法
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核酸提取原理及经验总结
一、核酸
核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最基本和最重要的成分。一般认为，生物进化即始于核酸，因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。今天已知核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。核酸是1869年米歇尔(F.Miescher)在脓液的白细胞中发现的。他当时称之为核素。阿尔特曼(R.Altmann)于1889年认识其酸性后，定名为核酸。
二、核酸的分类和功能
核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。这两类核酸有某些共同的结构特点，但生物功能不同。DNA贮存遗传信息，在细胞分裂过程中复制，使每个子细胞接受与母细胞结构和信息含量相同的DNA；RNA主要在蛋白质合成中起作用，负责将DNA的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。核酸的基本结构单元是核苷酸，核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3种组分。碱基与戊糖构成核苷，核苷的磷酸酯为核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脱氧核糖(核糖中2位碳原子上的羟基为氢所取代)。核酸就是根据其中戊糖种类来分类的，DNA和RNA的碱基也有所不同。下面我们看看DNA和RNA具体的差别：
（一）DNA的分子结构
1.DNA的碱基组成规律：Chargaff等根据分析各种生物及其不同组织内DNA样品水解液中的碱基含量的结果，得出以下结论：1）同一生物不同组织的DNA样品，其碱基成分含量相同。2）不同生物的DNA碱基成分含量不同。3）对某一生物讲，其碱基成分的含量不受年龄、营养及环境变化等影响。4）在同一生物的DNA碱基含量是A=T，G=C，A+G=C+T，碱基之间的这种关系称Chargaff法则。
2.DNA分子的基本结构：核酸分子内单核苷酸之间的连接键为3',5'-磷酸二酯键，是共价键。DNA分子的基本结构就是许多脱氧核糖核苷酸借磷酸二脂键相互连接而成的多核苷酸链。DNA链中碱基 的组成和排列顺序即为DNA的一级结构。DNA的遗传信息即储存在DNA分子的碱基排列顺序中。
.DNA分子的空间结构：DNA的二级结构是双螺旋结构，其特点为：1）两条链方向相反、相互平行、主链是磷酸戊糖链，处于螺旋外侧。2）碱基在螺旋内侧并配对存在，A与T配对的G与C配对，A与T之间二个氢键相连（A-T），G与C之间三个氢键相链（G-C）。3）螺旋直径2nm，二个碱基对平面距0。34mm，10bp为一螺距，距离为3。4nm。4）稳定因素主要是碱基之间的氢键和碱基对平面之间的堆积力。
（二）RNA的分子结构
RNA的基本结构是A、G、C、U四种碱基组成的核糖苷酸通过磷酸二酯键相链而成的多核苷酸链。有三种主要的RNA：据其作用可分转运RNA（tRNA）、信使RNA（mRNA）和核蛋白体RNA（rRNA），它们的二级 结构是单链局部双螺旋，共中tRNA结构较清楚：
1.tRNA tRNA一级结构特点是：1）核苷酸数目在70-90之间；2）含较多稀有碱基； 3）所有tRNA的3'末端均是-CCA的结构。tRNA二级结构特点： 呈三叶草形，有三环四臂。其中3'的氨基酸臂是携带氨基酸的位置，II环又称反密码环，此环顶端 由3个碱基组成反密码子，起到识别mRNA上对于密码子的作用。
2.Mrna mRNA是蛋白质合成的模板，真核生物的mRNA的5'端有m7Gppp的帽子，3'末端有20-200多聚A的尾巴上述两者之间为信息区，其中每三个相邻碱基组成一个三联体，代表一个氨基酸信号，即为密码子。不同mRNA具有不同的密码顺序，决定蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序（一级结构）。
3.rRNA 核蛋白体RNA，它是细胞内含量最多的RNA：rRNA与多种蛋白质结合成核蛋白体，存在于胞浆，是蛋白质 合成的部位。
三、核酸的理化性质
RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA。
四、细胞裂解：
（一）裂解原理
在核酸提取过程中，细胞裂解是非常重要的。经典的裂解液几乎都含有去污剂(如
SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等)和盐(如 Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境(如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏(如 EDTA)、维持核酸结构的稳定(如 NaCl)等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂(如 GIT、GuHCl 等)裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。
（二）细胞的裂解方法
细菌细胞破碎方法有以下几种：1）机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法，关于超声波处理法，要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间。2）化学试剂法：用含SDS或CTAB的溶液处理细胞，在一定的p H 环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相，p H 环境则由加入的强碱(NaOH)或缓冲液(TE、STE 等)提供，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,缓冲液中的一些金属离子螯合剂(EDTA 等)可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。；3）反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。4）酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶、蛋白酶K等，都可使细胞壁破碎，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4)键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 ℃及有EDTA、尿素(1～4mol/ L)和去污剂(0.5 %SDS 或 1 %Triton X-100)存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。
（三）裂解方法的评价
含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组 DNA 相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组DNA 是很容易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组 DNA “缠”住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高。另外一个思路是，如果基因组 DNA与
蛋白质 “缠”在一起，在纯化的过程中有两种可能：如果基因组 DNA 的特性占优势，则纯化时以 DNA 的形式被保留下来，导致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占优势，则纯化时以蛋白质的形式被去除，导致 DNA 的损失。当然去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组 DNA 抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用 PC 抽提的差一些。
高浓度蛋白质变性剂(如 GIT、GuHCl 等)的裂解方法，是抽提 RNA 的首选。总 RNA 的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质 “缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的 RNA 酶，从而确保了 RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法的样品 – 主要是植物，其它绝大部分样品的 RNA 的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。当然有些样品，如肌肉，即使是 RNA 抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液(或者在操作中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质)，原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的。该方法是获得最大得率和最高纯度的基础。
含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关：一是 CTAB 的质量，二是洗涤的彻底程度。CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不清楚原因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的 CTAB，批号不同，效果就可能差别很大。洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同时，CTAB 的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。裂解时的温度，多使用 65C；但如果发现降解严重或者得率太低，可以试一下 37C – 45C 这个相对低温的区域。
SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。蛋白质的沉淀效率在 4C 会更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4℃ 静置一段时间以及采用 4℃ 离心去蛋白质，都可以提高质量。该方法不一定要使用 PC 纯化，但结合 PC 纯化，可以获得纯度很高的质粒。RNA 的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A(100ug/ml)或者在最后的溶解液中加入 RNase A(25 ug/ml)来实现。总的感觉是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的残留少一些。不过，经典沉淀几乎没有办法彻底去除 RNA 残留。另外，对大质粒(50 kb 以上)，该方法可能会有问题。
PCR 模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非常快速。也正因为不纯化，所以，假阴性(即没有扩增出来的阳性)比例也比较高。该方法最简单的就是反复冻融法，简便快捷，不需任何化学试剂，冻融离心，PCR检测就可以了。如果使用裂解法，哪么最简单的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的 PCR 反应，而且能提高裂解效率，甚至还可能部分消除样品内抑制 PCR 反应杂质的东西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100 之类的能吸附部分杂质的介质。操作也非常简单，多使用温度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或者高温-低温的多次循环等。该方法最适合从一大堆样品中找出阳性样品，但却不适合用于判断某一个样品是阳性还是阴性。降低样品使用量可以提高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着 PCR 的抑制物量的降低。
（四）样品与裂解液的比例
选择了合适的裂解液，下一步就是要控制好样品与裂解液的比例。这个问题非常重要，但却没有获得足够的重视。严肃的参考资料，都应该会提供一个简单的比例，如 1ml 裂解液可以用于 T mg 组织或者 C 个细胞；建议:样品量绝对要小于资料所提供的。起始样品用多大，并没有具体的说法。如果不是样品量有限，则以能抽提出满足数次成功实验所需的核酸量，作为决定样品起始量的基础，会比较合理的。不要因为 1ml 裂解液可以抽提 100mg 样品，就一定使用 100mg 样品。裂解液的用量，表面上与抽提的结果(纯度及得率)没有关系，然而，在实际操作中，对结果是有比较大的影响的。裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。
五、核酸提取
核酸提取包含样品的提取和纯化两大步骤。提取是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。
（一）DNA提取的几种方法浓盐法 ：1）利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯化纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍 体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来； 2）也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白。两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些；3）以稀盐酸溶液提取DNA 时，加入适量去污剂，如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂。2 阴离子去污剂法：用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。苯酚抽提法： 苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。
4水抽提法：利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA淀溶于水中充分溶解于水中,离心后收集上清液。在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M，加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出。然后分别用66%，80%,95%乙醇以及丙酮洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品。此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用。为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS。
（二）RNA提取
所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点，即１）：样品细胞或组织的有效破碎；２）有效地使核蛋白复合体变性；３）对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；5）对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。
1）总RNA的试剂盒快速提取 一些公司推出的总RNA提取试剂盒,该总RNA纯化系统采用两种著名的RNA酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和β-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA,则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。
2）氯化锂法提取总RNA： 本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺陷。）蛋白酶－热酚法：本方法适合于病毒RNA的提取。
六、核酸纯化
裂解完成后，液体体系中就包括了游离的核酸、蛋白质及其它大分子杂质、盐：纯化就是将核酸与其它游离成分分离的过程。就个人所知，目前在科研领域广泛使用的核酸纯化技术主要可以分为两大类：使用介质的和不使用介质的，使用介质的，一次就将核酸与其它所有杂质分开；不使用介质的，一定是首先将核酸和盐与大分子杂质分开，再通过沉淀核酸使核酸与盐分开(PEG 沉淀和 LiCl 沉淀除外)。使用介质的可以分为两类：离子交换介质和吸附介质。不使用介质的也分为两类：使用苯酚/氯仿抽提的和不使用苯酚/氯仿抽提的。
（一）纯化方法：下面比较一下具体的纯化技术：
1）经典的使用苯酚/氯仿抽提的纯化技术：细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25 24 1 ∶∶体积)混合液。依据应用目的，两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸)或简单颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸)后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相,核酸则被留于上层水相。酚是一种有机溶剂，预先要用STE 缓冲液饱和，因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化发黄，而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联;故在制备酚饱和液时要加入82羟基喹咛，,以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪,使更多蛋白质变性,从而提高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸,改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入p H5.0～5.5，终浓度为0.3M 的NaAc 或KAc 后，钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷，在酸性环境中促进核酸的疏水复性。然后加入2～2.5 倍体积的乙醇,经一定时间的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有机溶剂[ 异丙醇、聚乙二醇(PEG)等]和盐类(10.0mol/ L 醋酸铵、8.0mol/ L 的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等)也用于核酸的沉淀。
2）使用离子交换介质的纯化技术：将裂解液过柱，核酸被联结在离子交换介质上；
洗涤去除残留的杂质后，用高盐缓冲液将核酸从介质上洗脱下来。再经过标准的乙醇/异丙醇沉淀、乙醇洗涤、干燥等操作，获得纯的核酸，溶解于合适的缓冲液中。3）使用吸附介质的纯化技术：将裂解液过柱，核酸被吸附介质选择性吸附；洗涤去除残留的杂质后，用水或者合适的低盐缓冲液将核酸从介质上洗脱下来，就可以直接用于后续实验。
4)密度梯度离心法：密度梯度离心也用于核酸的分离和分析。双链DNA、单链DNA、RNA 和蛋白质具有不同的密度，因而可经密度梯度离心形式形成不同密度的纯样品区带，该法适用于大量核酸样本的制备，其中氯化铯2溴化乙锭梯度平衡离心法被认为是纯化大量质粒DNA 的首选方法。氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质,梯度液中的溴化乙锭与核酸结合，离心后形成的核酸区带经紫外灯照射，产生荧光而被检测，用注射针头穿刺回收后，通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的核酸。
注：但是在日常实验过程中，通常用的纯化方法有主要有以下两种，一是化学方法，即PC 抽提 + 醇沉淀；二是物理方法，即介质纯化。第一种方法是利用 PC 对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。第二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了 PC 操作的麻烦。当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的 PCR。其它杂质 – 如多糖、多酚等的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。
（二）纯化方法评价
PC(P是英文酚的缩写，C是英文氯仿的缩写)抽提/醇沉淀方法，是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便。PC抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品(杂质为蛋白质)，该方法完全可以获得高质量的核酸。虽然每次 PC 抽提都会损失一部分核酸(因为不可能将水相全部移取)，以及低浓度核酸的醇沉淀效率低，但这些问题都可以靠操作的调整而得以解决或者减少影响。该方法的最大的问题是不适合大规模抽提。PC抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段。苯酚能使蛋白质变性，变性后的蛋白质从水相中被析出，处于苯酚中或者苯酚/水相之间。PC 抽提的关键是，一要混匀彻底，二要用量足够。彻底混匀，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触，使蛋白质完全变性。许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组 DNA 造成破坏，实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作，是会部分打断大分子的基因组 DNA，但该破坏作用不会强烈 到 DNA 变成 10kb 以内的小片段。手剧烈晃动混匀后，基因组 DNA 的片段，大部分会大于 20kb，这个大小，除了一些特别的要求外，对 PCR 和酶切，都是完全适用的。如果要求的片段非常大，如构建文库用，则不能使用剧烈的混匀方法，而只能来回温和颠倒混匀 – 此时的关键是：裂解液的比例要足够大，使体系不要太粘稠。用量要足够，是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，必须靠多次抽提，方可彻底去除。另外，体系太粘稠的坏处是，蛋白质难以彻底去除，以及基因组 DNA 会断裂得更厉害，所以要注意裂解液与样品的比例。4C 离心操作有利于更彻底去除蛋白质。PC 抽提的另外一个用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特点，在 RNA 抽提时获得 DNA 残留极少的 RNA。不过有一点要提醒的是，有些植物样品，在去除某些杂质之前，是不能使用 PC 抽提的，否则核酸必定降解。
高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。与 PC 抽提方法相比，除了纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了 PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提，不足是纯度(蛋白质残留)不够稳定。蛋白质的沉淀效率在 4C 会更好一些。
介质纯化方法，是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核酸抽提，并且因为受人为操作因素影响小，纯度的稳定性很高(虽然纯度不一定比PC 纯化方法更高)。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类则是颗粒状(如Glamilk、磁性小珠等)。颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀差别不大，都是通过数次的加液-倒液过程，干燥后，溶解即可获得纯化好的核酸。柱式纯化的操作虽然也是有加液-倒液过程，但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤更彻底，操作更省力(不用操心将核酸倒掉了，或者液体的残留)。不过，介质纯化方法的成本是最高的。
（三）醇的沉淀
1）沉淀的原理目的：目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质–主要是盐的分离。实际操作中，许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来，尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。醇的沉淀并不是非常特异性的，任何有机大分子及一些盐，当浓度达到一定水平后，都可能同步被沉淀下来。
就核酸而言，标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量，但这决不是说这些盐是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。实际操作中不难发现，当裂解体系中核酸的浓度达到一定水平后，即使体系中不含教科书中建议的盐，单独使用醇也可以使核酸沉淀下来； 或者含有盐，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下来(当然，得率可能会降低)。知道这一点的意义在于：不要迷信标准方法的唯一性；相反，当使用标准方法碰到问题 – 主要是纯度问题时，完全可以通过调整沉淀条件来改善。最有参考价值的是 TRIzol 提供的一个沉淀方案：一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。另外一个问题就是，要坚信核酸的醇沉淀过程同样也是其它杂质的沉淀过程；调整醇沉淀的条件，虽然会降低核酸的得率，但因为可以大大提高纯度。
2)沉淀剂的选择： 醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我没有发现这二者对质量有大的影响，虽然许多人“发现”乙醇沉淀的核酸纯度更高。异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀的核酸比较蓬松，容易从壁上移动，颜色比较白。这是现象，提示结论：异丙醇沉淀的核酸不容易丢掉，但比较难洗涤。结合丢失和洗涤两个方面综合考虑，则建议：少量核酸用异丙醇沉淀(量少，洗涤不是问题，不丢失为先)，大量核酸用乙醇沉淀(量大，丢失不是问题，洗涤方便为先)。至于异丙醇沉淀更容易沉淀下盐的说法，我没有碰到过(我几乎不使用低温沉淀，难道低温沉淀比较容易出现盐沉淀？)；我更觉得出现该现象的原因就在洗涤的不彻底。当然，也不要忘记异丙醇沉淀的最大优点是体积小，可以使绝大部分的小量抽提操作在 1.5ml 离心管内完成。但由于其沉淀物很紧凑，洗涤时其中心部分不容易被洗涤到，所以，洗涤异丙醇沉淀的核酸的关键是：一定要使沉淀悬浮起来，一定要放置一段时间使沉淀最终变成蓬松的白色。如果再洗涤一次，质量决不会有问题的。当然，沉淀所用的试剂，不仅仅就乙醇和异丙醇，还有包括PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀，虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率，但却各有特点。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来。PEG 是沉淀病毒颗粒的方便手段。3)沉淀温度的选择：如果核酸抽提的起始样品是杂质比较多时，原则上不要使用低温沉淀。低温沉淀能提高沉淀效率：当核酸浓度很低时，效果明显；当核酸浓度比较高时，效果不明显，但却会导致杂质的大大增加。
（四）核酸的洗涤
1）洗涤原理与目的： 洗涤对于整个提取过程来说，也是非常重要的。洗涤，首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要控制一定的时间，尤其是当核酸沉淀比较大时(使核酸沉淀最终蓬松)；第三是少量多次；第四则是去上清要彻底。教科书中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水纸上片刻”，这一描述本身没有问题，且十分方便，但因为他来自国外，自然就有了“水土不服”的问题。如果离心管是经过硅化的，因为液体几乎不挂壁，所以上清
可以去除得非常彻底；好的管子，即使没有经过硅化，残留量也非常少，也没有什么问题；差的管子，液体的挂壁非常可观，其残留量多到会影响后续的实验。唯一不受管子质量影响的操作，就是倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出。一定要牢记的是，残液中都含有上一步操作中的杂质，其残留量与混匀程度、核酸沉淀的大小都有关。挥发时去掉的是乙醇，杂质是不会被挥发去除的。这步，切忌不要用手甩，这样容易将核酸甩掉。另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也决定了洗涤的强度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越强，洗涤越要彻底：放置时间相对要长一点，洗涤次数也要考虑增加。当然，乙醇浓度的选择也非常重要，一般情况，洗涤一定要用室温的 75% 乙醇。
（五）核酸的溶解和保存
1）核酸溶解：纯化后的核酸，最后多使用水或者低浓度TE缓冲液溶解：其中 RNA 以水为主，DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。经典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，其中原因是有人认为 EDTA 可以减少 DNA 被可能残留下来的 DNase 降解的风险；如果操作过程控制得当，DNase 的残留几乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水(pH 接近 7)溶解 DNA。
2）核酸保存：基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。一般的我们选择，-20℃ 或70℃ 保存的稳定。如果温度不合适，保存中核酸发生降解或者消失，首要原因是酶残留导致的酶解，第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水解(RNA 在弱酸性更稳定，而 DNA 在弱碱性更合适)。还有一个不为人重视的，就是 EP 管对核酸的影响。首先一定要坚信一点，那就是核酸一定会与装它的容器的接触面发生反应，达到某种均衡。EP 管的材质，首先可能吸附核酸，其次还可以诱导核酸的结构发生某些变化，如变性。在核酸的浓度比较高时，这个现象可能观察不到；当核酸浓度很低时，则比较明显了。在低浓度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以稳定核酸，虽然已经为实验所证明，但许多实验人员并没有将该建议当回事。现在制造 EP 管的材料远多于过去。这些新出现的材料，在强度、透明度等物理特征方面可能比原来的纯 PP 材质要好许多，但其化学特征，尤其是对核酸稳定性的可能影响，远没有研究透彻。正如现在的质粒可以改造得越来越适用某些要求一样，其负面产物可能是，抽提的质粒电泳的构型越来越多：除了原来的三种带型外，还可能出现 denatured cc、multimeric forms of cc 等等带型。
（六）核酸的浓缩
应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可经离心而回收，甚至对低至pg量的DNA或RNA，也可定量回
收。回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。
核酸浓缩的具体操作时，可向含样品的小离心管中加入V/10单价阳离子盐贮存液2V无水乙醇，混匀，放冰水浴中15～30min，取出目测平衡，0～4度，12000g，离心10min。吸弃上清，再另70%乙醇0.5～1ml，12000g，0～4度洗涤离心2min。吸弃上清，沉淀用油泵抽干或打开盖子晾干后，溶于适当体积的缓冲液中。单价阳离子盐的选择，主要基于下述
考虑：用醋酸铵可减少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化时应避免用醋酸铵，因铵离子是T，多核苷酸激酶的强烈抑制剂。当用较高浓度的乙醇沉淀RNA时，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不随核酸共沉淀。含有SDS的核酸样品，应使用NaCl，这时该去垢剂要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸钠（pH5.2）。七 核酸质量的检测问题 将抽提好的核酸直接用于后续的实验，是唯一可靠的检测方法；除此之外的检测方法，都是相对的，而且并不十分可信。目前用于正式实验前检测核酸质量的方法，一是电泳，二是紫外分光光度仪。电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大(超出电泳分离范围)，该方法还是非常可信的；电泳还可以用于估计核酸的浓度，但其准确度与经验有关；另外，电泳也可能提供某些杂质污染的信息，但是同样与经验有关。紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度仪不能确保非常准确，而该仪器的灵敏度又非常高，所以，提供的结果并不十分可信。一般讲，同时进行紫外和电泳检测，综合二者的结果，可以做出一个更合理的判断。但由于这两个方法都有缺陷，所以，即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验，也不用大惊小怪。
关于紫外分光光度仪的检测。首先，不要使用不能选择波长的仪器；使用那些已经固定了波长的仪器，大概可以算是你梦魇的开始(没有信息是可怕的，更可怕的是将错误的信息当真，其中280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。)。其次，一定要经常调较仪器；调较可以使用非常纯的自备核酸，也可以使用苯酚。最后，要记住读数 A230 ：A260 ：A280 = 1：2(DNA 为 1.8)：1 为理论上的数据，实际测定时会有一些差别；但如果差别太大，就有问题了，有两个值得商榷的观点：如果 A260/A230 > 2 就是纯的，如果 A260/A280 > 2 就是核酸降解。A260/A230 如果比 2.0 大许多，一定是有杂质残留的(具体是什么杂质我不知道)。如果核酸抽提好后立即就测定，A260/A280 > 2.0 决不提示核酸降解，原因是：那些能导致 A260/A280 > 2.0 的核酸片段非常小，常规的沉淀是不可能将它们沉淀下来的；更可能的原因是：你仪器提供的 A260/A280 实际是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。纯的核酸的吸光值，在 A230 是谷底，在 A260 是峰顶，在 A280 则正好是半山坡。根据曲线在底和顶的斜率最小，在半山坡的斜率最大的特点，不难得出如下结论：A230 和 A260 的读数受仪器准确性的影响比较小，而 A280 受仪器准确性的影响比较大。
关于电泳检测，观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。
建议先电泳检测，再用紫外分光光度仪检测。电泳后，可以看到哪些样品根本就不能用(如降解太厉害)，以及核酸的大致浓度，这样就为紫外分光光度仪的检测提供了一个参考(降解的不必要测了，要测的该取多少量等)。
八、核酸中杂质的去除 关于核酸分离纯化阶段中除去多糖、蛋白质及不同类型核酸之间分离的一些方法，分别介绍如下：
（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处，常在提取液中残存下来。除去的方法常有：①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。
（2）蛋白质的除去：由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在，不论采用哪种方法提取核酸，蛋白质都不同程度地存在于体系中。因此，除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。常用方法有下列几种：①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分离纯化中也常反复使用。③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。
（3）不同类型核酸的分离：两种类型核酸的制备过程中，DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。由于DNA和RNA结构和性质都很相似，而且分子量都十分大，所以两类核酸的分离是核酸纯化工作中比较复杂和繁琐的一步。从DNA中除去RNA的方法常有：①核糖核酸酸酶选择地破坏RNA，这是比较有效的方法，但使用的核糖核酸酶中常含有极微量的脱氧核糖核酸酶，必须事先加热处理除去，然后将纯净的核糖核酸酶与样品溶液一起在37℃孵育数分钟，就可达到破坏RNA的目的。②钙盐分步沉淀：在核酸溶液中加入1/10体积10%的氯化钙溶液，使DNA与RNA均成为钙盐后，再利用DNA钙盐在2/10体积乙醇中能形成沉淀析出，RNA钙盐不形成沉淀而彼此分离。③活性炭吸附：将处理好的活性炭按1/15～1/20体积加入每毫升含有0。5～1mgDNA溶液中，0～4。C下搅拌1h，以31000×g离心1h，除去RNA后的DNA回收率可达94%。
在RNA制品中除去DNA，苯酚水溶液抽提是较有效和常用的方法。在没有阴离子化合物存在下，以等体积90%苯酚水溶液反复抽提RNA，可以除去绝大部分DNA。此外，也可采用加入脱氧核糖核酸酶处理，破坏DNA，或参考上述DNA与RNA分离方法将DNA除去。
（4）同类核酸的分离 ：①RNA混合物的分离：经过提取的初步纯化的RNA制品中含有各类RNA和某些已降解的RNA混杂物。进一步纯化时，多应用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法。例如tRNA与rRNA的分离用吸附于硅藻土表面的甲基化白蛋白柱吸附后，以不同梯度氯化钠溶液洗脱，或用蔗糖梯度（顶部5%浓度，底部20%浓度）离心法分开。mRNA的代谢速度较快，在细菌中平均寿命为90min，在哺乳动物中约为几小时至十几小时，常用密度梯度离心法和DNA-琼脂柱进行分离。制备rRNA时，由于共沉作用，常混有mRNA，一般可用萘-1，5-二磺酸处理，使二者分开。各种tRNA的提纯，通常采用逆流分溶法在磷酸缓冲液-甲酰胺-异丙醇系统下进行，分离效果较好。②DNA混合物的分离：主要是变性或降解的DNA和天然的分离，常用磷酸钙、ECTEOLA-纤维素、DEAE-纤维素和甲基化白蛋白柱层析，逆流分溶，梯度离心等方法。一个具有生物活性高度提纯的DNA制品应具有如下标准：不含有蛋白质及多糖；不含有可透析的小分子杂物；在pH7时紫外吸收最大值在257～261μm之间，E（P）在6600左右；不含有RNA；固体为纤维状，水溶液具有高的粘度并有流动双折射作用；具有电泳均一性及超离心中单分散性；具有生物活性。
一、植物核酸提取
1976 年，Millgan 用Blin 和Stafford 描述的方法分离了植物DNA，然而这些DNA 是不能用于克隆的。在发明了去除植物DNA 上污染物的方法之后，人们可用分离动物组织DNA 的方法分离植物DNA。去除植物带电高分子污染物的方法有核分离（Bickle 等1977）。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）分离（Murray，Thompson 1980）和盐酸／十二烷基肌氨酸钠分离（Sung，Slightom 1981）等。在这些方法中，CTAB 方法因简便、快速而使用最广泛。收集和保存植物组织的方法对于 DNA 的产量和质量也有很大影响。虽然已能成功地从植物标本和化石中分离出 DNA（Doyle，Dickson 1987），但采用新鲜材料能产生最好的结果，特别是对于产生大量单宁、酚或其他次级代谢产物的种。如材料不能马上进行提取，应保存在冷而湿的地方，例如在冰盒中。如有必要可以冷冻保存。如果没有条件，最好在无水CaSO４瓶中快速干燥（Liston 等 1990）。DNA 的提取应尽快进行，以防其降解（Pyle，Adams1989）。提取DNA 的过程中有许多因素能导致DNA 降解。首先是物理因素。因为DNA 分子量较大，机械张力或高温很容易使DNA 分子发生断裂。因此，在实际操作过程中应尽可能轻缓，尽量避免过多的溶液转移及剧烈的振荡等，以减少机械张力对DNA 的损伤，同时也应避免过高的温度。其次，细胞内源DNA 酶及细胞破裂释放的次级产物也会导致DNA 降解。所以在提取DNA 的实验中，设计了许多可供选择的分离缓冲液，以适应不同的植物材料。分离缓冲液的pH 值有时需要进行改进，pH 应避免接近降解酶的最适点。大多数降解酶和脂肪氧合酶pH 值的最适点在 5.0～6.0 之间，而DNA 酶pH 值最适点在 7.0 左右（Dunham，Bryant 1963）。由于在过酸的条件下，DNA 脱嘌呤会导致DNA 的不稳定，极易在碱基脱落的地方发生断裂，所以大多植物DNA 提取缓冲液的pH 值为8.0，有的甚至为9.0。缓冲液中包含了大量的复合物，如 EDTA（乙二胺四乙酸）、SDS（十二烷基硫酸钠）、牛血清白蛋白（BSA）、β-巯基乙醇、谷胱甘肽、二硫苏糖醇（DTT）、抗坏血酸（Vc）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、二乙基焦碳酸盐（DEPC）、溴化乙锭（EB）等（Hallick等1977）。但由于上述物质有些是抑制内切酶和非特异性核酸酶的，所以在其后的步骤中要将其除去。分离DNA 与蛋白质一般采用苯酚－氯仿抽取的方法。苯酚、氯仿对蛋白质均有极强的变性作用，而对DNA 无影响。下面的方法描述DNA 与污染物多糖的分离，也可用阴离子交换层析仪来进行。下面列出了3 种常见的分离植物总DNA 的方法。3 种方法溶解细胞膜和分离蛋白质的方法不同，各有其优、缺点。DNA制备
（一）植物总DNA的提取）CTAB 缓冲液方法：这是最广泛地用来分离植物DNA 的方法，对大多数植物种都适用，特别是当样本数量很小时。此法运用阳离子去污剂CTAB 溶解植物细胞膜，并与DNA 形成一复合物。其优点是不需要准备大量的植物组织，而且适合像叶、根、种子、胚、胚乳、花粉和悬浮培养的组织等多种类型的组织（Rogers，Bendch 1985）。另外，此法对样品数量的要求也不高，从小到毫克数量的标本（木乃伊、化石）到许多克的新鲜材料均可使用（Golenberg 等 1990；Rogers Bendch 1985）。A ：CTAB 的实验方法
1．材料（1）2 倍CTAB 缓冲液： 100 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0 1．4mol／dm３NaCI 20 mmol／dm３EDTA 2％ CTAB（W／V）1％ PVP-360（W／V）0．2％ß-巯基乙醇（体积比，用前在通风橱中加）（2）清洗缓冲液： 76％乙醇 10 mmol／dm３乙酸铵（3）悬浮缓冲液： 10 mmol／dm３乙酸铵 0．25 mmol／dm３EDTA，pH 值 8． 2．步骤
1）加热分离缓冲液、研钵、研杵到60℃。
2）在热研钵中放人0．5～1．5g 新鲜或冰冻的叶子，用7．5ml 2 倍CTAB 分离缓冲液研磨（可加些石英砂帮助研磨）。对冻干的组织用1 倍CTAB 缓冲液研磨。把研碎的组织倒入50ml 管中，再用0．5ml 2 倍CTAB 缓冲液冲洗研钵，将冲洗液加到管中。
3）将试管在60℃下放置30～60 分钟，然后轻轻振荡，使之充分混合后降至室温
4）在试管中加入10ml 氯仿－异戊醇（24：1）萃取液（如颜色深可再进行一次），轻轻摇晃使其混合，在室温下1500r／min 离心5 分钟，使其分相。
5）将上层的水相倒入－15ml 管中，加2／3 体积的冷异丙醇，轻轻混合以沉淀核酸。如果
看不到核酸沉淀，可在－20℃下放置20 分钟或更长时间。6）室温下 800r／min 离心 3～5 分钟，如果看不到小团或沉淀，可在－20℃下放置 20分钟再离心。
7）小心地倒掉上清液，不要倒掉核酸，这时的核酸一般松散地贴在管的底部，加 15ml清洗缓冲液，轻轻地旋转清洗沉淀物，15～20 分钟后核酸将变得更白。
8）室温下800r／min 离心5 分钟（如不充分，则加大离心速度或延长离心时间），倒掉清洗缓冲液，将管倒扣在纸巾上，让沉淀物干燥，小心不要让DNA 滑掉。
9）按沉淀物的大小用少量悬浮缓冲液（10～100 μl）悬浮DNA。l0）用100μg／ml RNAase 在 37℃下温育 30～60 分钟。11）如果组织包含单宁或其他次级产物，可以对 DNA 作进一步纯化（可用氯仿、苯酚纯化）。一些材料可能需要用氯铯（CsCl）梯度纯化。上述方法也可以进行改进，像巯基乙醇的浓度可以提高至 25mmol／dm３，也可加入 l％的抗坏血酸、DTT 等，CTAB 也可用 SDS 取代（Golenberg 等1990），也可用 TE（10mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8。0，lmmol／dm３EDTA）作悬浮缓冲液。B ：CTAB 沉淀法
1．材料 2 倍CTAB 分离缓冲液；沉淀缓冲液： 100 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0；20 mmol／dm３EDTA；2％CTAB（w／V）。2．步骤
1）与A中前4 个步骤同。
2）吸取上层水相，将其例入一个15ml 管中。
3）加 3 倍体积的沉淀缓冲液，使NaCI 的浓度减少到 0．35mol／dm３，室温下放置 30分钟。
4）室温下 2 000r／min 离心 5 分钟，以沉淀 DNA。
5）根据沉淀物的大小，用少量的悬浮缓冲液（10～100μl）悬浮DNA。6）虽然氯仿或苯酚提取DNA 是有效的，但是对那些包含单宁或其他次级产物的组织，可以在氯化铯梯度上进一步纯化。
（二）从植物组织提取基因组DNA1、材料
水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。
2、设备
移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1。5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。
3、试剂
1）提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8。0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5%SDS。
2）提取缓冲液Ⅱ：18。6g葡萄糖，6。9g二乙基二硫代碳酸钠，6。0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。3）80：4：16/氯仿：戊醇：乙醇 4）RnaseA母液：配方见第一章。
5）其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。
4、操作步骤：
（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取
1）在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。2）水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。
3）加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
4）室温下5000rpm离心5分钟。
5）仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。6）在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。7）如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。
8）将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。9）加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。
10）加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分左右,DNA形成絮状沉淀。
11）用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。12）将DNA重溶解于1ml TE,-20贮存。
13）取2μl DNA样品在0。7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。
[注意] 5g样品可保证获得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。
（三）从李(苹果)叶子提取基因组DNA 1）取3-5克嫩叶, 液氮磨成粉状。
2）加入提取缓冲液Ⅱ10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。3）去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混匀。65℃, 30-60min, 常摇动。4）同本节
（一）中步骤3-13操作。二 从动物组织提取基因组DNA
（一）动物组织提取基因组DNA1、材料
哺乳动物新鲜组织。
2、设备
移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。
3、试剂
1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7。4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K(20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。
4、操作步骤：
1）切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。
2）倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。3）加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。
4)加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保温1-2小时, 直到组织完全解体。
5)加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。
6)取上清液于新离心管，用等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。
7)取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。8)移去上层乙醚,保留下层水相。
9)加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。10)用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。
11)如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清;如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA 12）以分光光度计测定DNA 的浓度（260nm），260／280nm 的光密度比值应在 1．8 以上，否则提示可能有蛋白质或苯酚的污染。13）以TE 溶液将DNA 样品稀释成所需的工作液的浓度。
14）取2μl 左右的样品进行电泳检测，以判断 DNA 是否有降解以及是否需要消除RNA(二）微量动物组织样品的总DNA 提取方法
从微量组织中提取DNA 的方法是1989 年由Singer-Sam（Walsh 等1991）发展起的。此方法的基本原理是采用 BioRad Chelex 100（一种螯合剂）提取DNA。此方法简便
快速，提取后的DNA 样品可以直接作为PCR 的模板。具体的操作步骤如下：
1）取一小块冰冻的组织（少于1mg，可用经消毒的枪头钻取），或1～3 根带有毛根的毛发（需先经 90％、70％的乙醇和灭菌水依次清洗，并剪去毛干部分），或 1～5μl 血液，加入经过高温消毒的离心管中。离心管内事先加入 500μl 5％的Chelex 溶液。
2）将样品管在56℃下放置1 小时或更长时间，直至组织样品成粉末状（不同组织所需时 间各不相同）。3）在振荡器上振荡10～15 秒钟。4）在 95～100℃下煮 15～40 分钟。5）在振荡器上振荡10～15 秒钟。
6）将样品管在4℃下保存，进行PCR 反应之前再次离心，使Chelex 颗粒沉淀。取上清液（1～10μl）作为DNA 模板。
（三）陈旧、古老DNA 样品的提取方法
对于陈旧、古老DNA 的研究始于80 年代中期。1985 年，Paabo 采用克隆的手段首次从古埃及木乃伊中提取并测定了一段DNA 序列。然而，较为广泛地开展对古老DNA 的研究是在多聚酶链式聚合反应（PCR）发明以后才开始的（Mullis，Fallona 1987）。
经过一定时期的物理、化学作用（几十年至几百万年）的DNA 往往存在比较严重的降解，DNA 片段常常仅有几百个bp 的长度，并且可能存在碱基的修饰和一些抑制PCR 反应的物质。因此，在从陈旧或古老样品中提取DNA 时，最为关键的问题就是防止现代DNA 的 污染。进行DNA 提取操作的所有器皿、器械和试剂均要进行灭菌处理，提取过程应在超净台中进行。此外，提取时应设阴性对照，以监测是否存在外源DNA 的污染。下面介绍的是一种较为简便的提取方法。1）取样品少许（如哺乳动物的皮张可取 1cm × 1cm 见方的小块），用剪刀、手术刀等器械对样品表面进行处理，除去最容易遭受外来污染的表层。对于骨骼、琥珀等坚硬的样品则需要用小钢钻等特殊器械从内部取得样品。
2）经过表面处理的样品用90％乙醇、70％乙醇和去离子水依次进行清洗。
3）在灭菌的 Eppendorf 管中加入 200μl 去离子水、10μl 蛋白酶K（10mg／ml）和 1／10 体积的（20μl）10％的β-巯琉基乙醇。处理过的样品放入上述溶液前要尽可能剪碎。4）在56℃下消化48 小时。
5）样品管中加入等体积的5％～10％的Chelex100 溶液，在旋涡混合器上振荡5～10秒钟，然后在98℃下放置20～60 分钟。6）振荡混合5～10 秒钟，并使之冷却至室温。7）12 000r／min 离心 5～10 分钟。
8）小心取出上层清液，置另一干净的管中保存。
（三）细菌基因组DNA的制备
1、材料 细菌培养物。
2、设备
移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。
3、试剂
1）CTAB/NaCl溶液：4。1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。
2）其它试剂：氯仿：异戊醇(24：1)，酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K(20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。
4、操作步骤：
1）100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。2）加9。5ml TE悬浮沉淀, 并加0。5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。3）加1。5ml 5mol/L NaCl, 混匀。
4）加1。5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。5）用等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。
6）用等体积氯仿：异戊醇(24：1)抽提, 取上清液移至干净管中。7）加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。8）用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE,-20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。9）如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。
（五）真菌DNA的提取
1）取真菌菌丝0。5g, 在液氮中迅速研磨成粉； 2)加入4mL提取液，快速振荡混匀；
3)加入等体积的4mL的氯仿：异戊醇(24：1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚，可以节约成本的哟！）； 4)1000rpm，4℃，5min；
5)上清用体积的氯仿：异戊醇(24：1)再抽提一次（10,000 rpm，4℃离心5 min）；
6)取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2。5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min；
7)用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500 ；
8)加入1 ul RNaseA（10 mg/mL），37℃处理1 hr；
9)用酚（pH8。0）：氯仿：异戊醇(25：24：1)和氯仿：异戊醇(24：1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）；
10)取上清，1/10V 3M NaAc,2。5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30 min以上；
11)沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ulTE中，-20 ℃保存备用。RAN提取
(一）细菌RNA的制备 1）菌体培养简略。
2）离心收集菌体菌体 经离心（5000g，5min）后，悬浮于终止缓冲液中（200mM Tris-HCl，pH8。0;20 mM EDTA;20 mM Na2N3;20 mM 金精三羧酸(ATA)）3)菌体裂解
加入STET缓冲液(8% 蔗糖;5% Triton X-100;50mM EDTA;50mM Tris-HCl pH 7。0)悬浮加入0。2 M 的VRC(0。2M和10 mM的氧钒核苷复合物)4)RNA提取 加入0。5 V的苯酚振荡1 min,0。5 V氯仿振荡1 min,10 000 g, 10 min,水相加入1/10 V的NaAc, 2 V的无水乙醇10000 g, 10 min沉淀溶于0,2 M 的VRC,以酚-氯仿抽提两次 5)RNA纯化 重溶沉淀于DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水中,加入CsCl溶液,于室温离心(200000 g,1 h)回收RNA沉淀,溶于DEPC处理的水中,加入1/10 V的3 M的NaAc, 2 V的乙醇,离心后 6．RNA的溶解 将RNA沉淀溶于水中(二)植物组织细胞RNA的制备 1)细胞处理： 将植物组织置于液氮中冻结，研成粉末，加入匀浆缓冲液，高速匀浆，后高速离心（20000g，10 min）2)RNA提取：上清液中加入皂土(4%),等体积的酚,低温振荡5min，200000 g, 10 min 3)重复该步骤一次 4)RNA沉淀： 于上清液中加入KAc至终浓度为0。2 M,加两倍体积 的无水乙醇,于0oC 30 min，30000g,20 min 5)RNA的溶解：沉淀溶于水中或TE缓冲液(三)哺乳动物细胞质RNA的制备 1)细胞培养： 人工组织培养2)细胞裂解：以含磷酸缓冲液（PBS）的生理盐水洗细胞悬浮于预冷的溶胞缓冲液中，加入24%的蔗糖，1%的NP-40溶胞缓冲液 3)去蛋白： 加入Protease K，于37 ºC温育30 min，酚抽提 4)去DNA：乙醇沉淀,悬浮于DNA消化液(DNase I, 0.2% SDS)5)沉淀RNA： 加入终浓度为0。3 M的NaAc, 2V 无水乙醇于-20 ºC 2 h, 离心收集RNA。
（四）真菌菌丝的总RNA的提取
RNA提取缓冲液（CTAB）：2% CTAB（W/V），2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V），100 mM Tris-HCl（pH8.0，DEPC处理的水配置），25mM EDTA, 0.5g/L 亚精胺Spermidine，2.0M NaCl，2%巯基乙醇（V/V，使用前加入）。由于在高温灭菌条件下，Tris-HCl要和DEPC发生反应，所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC 处理的水配制即可。SSTE：1 M NaCl，0.5% SDS（W/V），10 mM Tris-HCl pH8。0，1。0 mM EDTA 10M LiCl 直接用蒸馏水配10M LiCl，加1‰的DEPC过夜后，高温灭菌。
3M NaAc 氯仿：异戊醇（24：1）酚（pH4.5）：氯仿：异戊醇（25：24：1）DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜，高温灭菌 无水乙醇 70%酒精。
1）实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热，离心管中加入ME（巯基乙醇）（10mL 加80ul，50mL中加入300ul）；
2）取约0.8g菌丝体（液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了），在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50 mL离心管，按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液，颠倒混匀； 3)65℃水浴3-10 min，期间混匀2-3次；
4）加入等体积的酚（注意是酸酚pH4.5）：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提（10,000 rpm，4℃，5 min）；
5）取上清，等体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提（10,000 rpm，4℃，5 min）；
6)加入1/4V体积10M LiCl溶液，4℃放置6hr以上(或过夜)； 7）10,000 rpm，4℃离心20 min； 8）弃上清，用500 ulSSTE溶解沉淀；
9）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提两次, 氯仿：异戊醇（24：1）抽提1次（10,000 rpm，4℃，5 min）； 10）加2V体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30 min以上； 11）12,000 rpm，4℃离心20 min；
12）弃上清。沉淀用70%酒精漂洗一次，干燥； 13）加200 ul的DEPC处理水溶解；
14）用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量（在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数）； PCR 小量制备法
此方法的优点是一次可以提纯很多样品，比较快速，而且小于10mg（50mm）的新鲜叶子材料就可以产生足够的DNA，产生的DNA 对杂交实验是可用的（Millgan 1992）。这个方法存在的问题是DNA 沉淀物可能不够紧密，或不一定能形成一紧密的DNA 沉淀。1.材料
分离缓冲液：200 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0；250 mmol／dm３NaCI；25 mmol／dm３EDTA；0．5 ％ SDS。2.步骤
（1）用1．5ml 离心管研磨小的组织样品。可取管口大小的新鲜叶子（＜10mg），冻在液氮中的叶子也可用。
（2）在研碎的样品中加 400μl 的分离缓冲液，用适合的速度涡旋 10 秒钟，以分散开样品。（3）在室温下将1．5ml 离心管中样品离心 12～15 分钟，沉淀细胞内物质。（4）搜集300μl 的上清液，弃去沉淀。（5）在上清液中加300μl 预冷异丙醇，倒转样品1～3 次，使之充分混合，在室温下至少放置5 分钟。
（6）将微离心管中的样品在室温下离心20 分钟，以搜集沉淀的DNA。（7）弃去上清液，用300μl 80％的乙醇室温下沉淀 10 分钟。（8）室温下离心样品12 分钟，弃去上清液。
（9）用300μl 80％的乙醇再洗后，室温下离心 5 分钟，弃去上清液。
（10）室温下干燥样品1 小时或将样品放过夜。（11）用 100μl TE 悬浮样品。
