电镜演讲稿_talos电镜

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在这项研究中，David Julius及同事将低温电子显微镜与脂质纳米盘技术相结合，获得了处在一个膜双层中的辣椒素受体TRPV1的结构。他们的结果揭示了脂质和配体调控的机制

两项研究分别对大鼠TRPV1闭合和开启状态下的结构研究，结果表明，TRPV1有一个独特的双门通道激活机制，结果表明，TRPV1有一个独特的双门通道激活机制。这两项研究是由加州大学旧金山分校凯克先进的显微镜实验室和加州大学旧金山分校生理学系分别独立完成相关文章发表于2013年12月04日的《Nature》杂志上。

在两篇相关联论文的第一篇中，Maofu Liao 等人获得了大鼠TRPV1(辣椒素受体——辣椒素是辣椒中的辛辣成分)在一个“封闭”状态下的高分辨率低温电子显微镜结构。该结构总体上与电压门控的离子通道的结构相当相似，但有TRP通道特有的几个结构特点。

在第二篇论文中，Erhu Cao等人发表了大鼠TRPV1在一种肽神经毒素(Resiniferatoxin)存在时和在辣椒素存在时的结构，从而提供了该通道激活状态的结构。对闭合和开启状态下的结构所做比较显示，TRPV1有一个独特的双门通道激活机制。

结构生物学，发表来自美国加州大学高分辨解析细胞膜通道如何开放关闭的结构，显然十分精彩。两篇《Nature》论文报道了分辨率为 3.4 埃的 TRPV1 蛋白的结构。第一篇《Nature》文章描述了 TRPV1 处于静息状态时的结构，蛋白质结构研究的手段主要有三种——X 射线晶体学、磁共振和电子显微术，在目前获得的近1500 个膜蛋白结构当中，90% 以上的都是由X 射线晶体学得到的。然而，随着低温电子显微三维重构技术在近5~10 年来的飞速发展，用低温电镜来观察和研究膜蛋白(特别是膜蛋白复合体)的结构和动态变化开始受到青睐，可以预见，在未来的5~10 年内，将会在越来越多的膜蛋白结构研究报道中出现低温电子显微技术的应用。今天《自然》两篇结构生物学研究就是采用的低温电子显微镜技术

为解析TRPV1的结构，Liao等只采用单颗粒低温电子显微镜，充分利用多种先进技术。首先用分子生物学技术建立一种结构较小但稳定性更好的大鼠TRPV1分子，然后把纯化的TRPV1分子导入脂质体以维持通道的稳定性和水溶性，用可直接探测电子的照相机采集数据，用最先进计算机程序，通过统计学方法估计颗粒方向并计算出精确的分子结构。他们通过该技术获得8.8 Å分辨率的显微镜下分子结构，并最终获得3.4 Å局部高分辨率结构。这一结构足够识别氨基酸残基链和β折叠，可识踪蛋白的骨架多肽。过去采用该技术对TRP通道研究只能达到15–19 Å的分别率。因此这是单颗粒低温电子显微镜技术上的一次里程碑意义的研究，在使用该技术研究复杂大分子结构方面也具有划时代意义。更重要的是，该研究中高分辨率区域接近与分子中心。

目标蛋白是热敏感TRPV1离子通道，（在疼痛和热知觉中起中心作用的一种蛋白质的结构）这个通道全称为瞬态电压感受器阳离子通道子类V，成员1。TRPV1是一个配体门控非选择性阳离子通道，可被各种外源性及内源性理化刺激激发，如物理的刺激(温度、机械力等)和化学刺激(pH 值、信息素等如温度超过43度、pH值低、内源性大麻素、花生四烯酸、乙醇胺、N-花生四烯酰基多巴胺和辣椒素等。这一通道广泛存在于酵母到人类等多种物种，在人类存在于中枢神经和外周神经系统，在痛觉传递和调制，整合各种同疼痛信息等方面发挥重要作用。一篇的重点是结构描述和热敏感位点

此次报告的目的在于带大家认识一种极具应用和发展潜力的技术-冷冻电子显微学技术，以及对最近来自加州大学旧金山分校的程亦凡研究组因该技术在生物大分子结构解析方面取得的重大突破而发表在nature杂志上的一篇通讯文章做简要的介绍。冷冻电镜作为一项生物物理学技术，如今的应用已是越来越广泛，特别是近些年来，由于最新的信号探测器的应用，以及单颗粒三维重建算法的革新和不断改进，冷冻电镜技术取得了飞跃式的发展。通过该技术解析得到的生物大分子结构可以在单分子条件下达到近原子分辨率(

1、S3、S4域上存在着一个疏水芳环层，这个芳环层使得Y44、Y441、Y554等氨基酸残基被小分子非芳香族残基取代进而形成了多个的微小孔道结构（具体是如何实现取代的过程该文并未给出解释），而且在赋予跨膜阿发螺旋S1—S4结构域以一定刚性的同时在某种程度上可帮助S4—S5 linker的移动来调整TRPV1离子孔道的闭合状态，在TRPV1被激活过程中它始终是保持静止的，另外，在其外表面上具有亲脂性配体如辣椒素和树胶脂毒素等的结合位点，在其内侧是由一个跨膜阿发螺旋S5—P—S6域构成，这个结构长得有点像倒置帐篷的形状，实际是一个凹形环内加一个空隙螺旋结构组成，这两种跨膜结构域主要是通过与膜呈平行关系的螺旋S4—S5linker连接在一起，当深入孔道时，他们发现了一个很短的选择性过滤器，其上的骨干羰基或侧链紧密地分布于中央孔道内，分子模拟预测，直径一般在6埃左右，且会随着TRPV1通道的激活而变大，这是TRPV1亚基结构细节，具体的，由TRP domain基因片段表达翻译形成的蛋白结构如图所示，TRPdomain它是由21—25个氨基酸残基组成，参与通道蛋白的组装过程，在这个结构域中心附近的一个W697氨基酸残基与处在主链上的一个F559氨基酸残基形成了一个氢键，此图旋转90度角后得到preS1的螺旋立体结构图，他主要是依靠氢键和盐桥与TRPdomain发生相互作用，再就是在该离子通道中存在有6个锚蛋白序列，其中四个处于氮端一侧，余下两个在碳端上，两者经由一条贝塔链连接在一起，而这条贝塔链与linkerdomain上的反向平行贝塔结构在离子通道的形成中扮演着重要的角色，锚蛋白序列是由内阿发螺旋与外阿发螺旋组成，其中ANK3、4的内阿发螺旋与3股碳端的贝塔折叠发生了相互作用，使通道蛋白浸在细胞质中这一部分牢牢的被包裹在了一起，并且他们还发现了ATP被结合在由ANK1—3形成的凹面上，可稳定ARD的折叠结构，对通道蛋白的调节具有重要的作用 在生物学功能中起关键性作用，如信息传递，神经传导，研究离子通道的结构对理解生物学功能及基于功能的药物设计是具有重要意义的。由于离子通道开放的时间很短（由毫微秒到毫秒），很难用X射线晶体学来研究其结构。应用冷冻电镜技术，可将分子冻结在不同的功能状态，因而可研究这些不同状态的结构。

它是一种采用cyo-EM技术，首先要将感兴趣的蛋白质放置在一种水溶液中，然后在非常薄的冰层中冻结蛋白质，其速度非常的快以致水根本没有时间形成结晶。而至关重要的是这种冰仍保持在一种玻璃状态，因为形成任何的冰晶体都会损害嵌入在冰内的蛋白质，干扰测定天然构象中的蛋白质结构就像困在琥珀中的昆虫一样，多个拷贝的蛋白质悬浮在这一玻璃状冰中，研究人员捕获了多达10万幅图像，然而组合成千上万的二维图像进行计算生成了蛋白质的三维结构。

意义：意义：这一研究对深入开展类似离子通道结构的研究具有促进作用，由于TRPV1等离子通道和痛觉的感受有密切关系，这一些研究将为人类寻找理想的镇痛药物提供重要支持。由于程一凡实验室取得的巨大进展，能够精确地捕获蛋白质的形状改变现成为了低温电子显微镜的一个巨大优势，他预计许多结构生物学家，甚至是那些支持X射线晶体学的人，也将会把低温电子显微镜添加到他们的工具箱中。

冷冻电子显微学解析生物大分子及细胞结构的核心是透射电子显微镜成像，其基本过程包括样品制备、透射电子显微镜成像、图像处理及结构解析等几个基本步骤（图3.1）。在透射电子显微镜成像中，电子枪产生的电子在高压电场中被加速至亚光速并在高真空的显微镜

内部运动，根据高速运动的电子在磁场中发生偏转的原理，透射电子显微镜中的一系列电磁透镜对电子进行汇聚，并对穿透样品过程中与样品发生相互作用的电子进行聚焦成像以及放大，最后在记录介质上形成样品放大几千倍至几十万倍的图像，利用计算机对这些放大的图像进行处理分析即可获得样品的精细结构。基本原理就是把样品冻起来然后保持低温放进显微镜里面，利用相干的电子作为光源对分子样品进行测量，透过样品和附近的冰层，透镜系统把散射信号转换为放大的图像在探测器上记录下来，最后进行信号处理，得到样品的三维结构。

瞬时感受器电位离子通道蛋白是一类组织分布非常广泛的非选择性阳离子通道蛋白。到目前为止,有超过30个TRP通道家族成员在哺乳动物中先后被克隆。TRPV 1是近年研究较多、机制较为清楚的TRPV亚家族成员之一,主要分布于外周感觉神经。研究表明, TRPV 1通道蛋白可被多种外源或内源性介质敏化或激活,其主要生理功能是感受热、痛等伤害性刺激,且与炎症、咳嗽等多种病理过程密切相关。

辣椒中的辛辣成分—辣椒素(capsaicin)和树胶脂毒素(RTX)可使其活化,因此TRPV 1又被称为辣椒素受体TRPV 1除对辣椒素敏感外,还可被多种配体样物质、炎性介质(如花生四烯酸代谢物)、组织损伤刺激物等激活[3]。另外, TRPV 1也可被非选择性刺激物,包括热(> 43℃)、酸(pH

在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术，就叫做冷冻电子显微镜技术，简称冷 冻 电 镜。冷冻电镜是重要的结构生物学研究方法，它与另外两种技术：X射线晶体学和 核 磁 共 振 一起构成了高分辨率结构生物学研究的基础，在获得生物大分子的结构并揭示其功能方面极为重要。

具有里程碑意义的成果是，2013 年加州大学旧金山分校(UCSF)程亦凡和 DavidJulius 的研究组首次得到膜蛋白 TRPV1 的 3.4 Å 近原子级别高分辨率三维结构，结果发表在 Nature 上,这篇文章主要是利用单颗粒分析法，结合先进的计算机算法和电子探测技术，成功的解析了trpv1通道蛋白结构，如图是他们获得蛋白结构图，从这张图可看出

冷冻电镜目前已经成为了一项应用越来越广泛的生物物理学技术。特别是近些年来，由于最新的信号探测器的应用，以及单颗粒三维重建算法的革新和不断改进，冷冻电镜技术取得了飞跃式的发展。通过该技术解析得到的生物大分子结构可以在单分子条件下达到近原子分辨率(

该方法不需要蛋白质分子形成晶体结构并且仅需要相对较少量的生物样品，通过快速冷冻可以获得生物大分子的天然状太，硬件和软件的发展使得单颗粒冷冻电镜可以得到近原子分辨率的生物大分子结构，极大地提高了冷冻电镜的应用范围。另外图像采集以及数据处理的效率较之前都有了很大的提高，越来越多的高分辨大分子结构通过该技术被解析出来

S1至s之间大部分的氨基酸残基被解析出来，如图分别是 的氨基酸残基组成及排列顺序，