生化教案第五章_高职班生化教案
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第五章 核酸化学 第一节 概述
一、染色体、基因和DNA1、染色体和基因----遗传的基本单位
染色体是细胞核内能被碱性染料着色的物质的螺旋集缩体，由核酸、组蛋白、非组蛋白等组成。
经典遗传学认为，染色体和基因间有平行现象，基因存在于染色体上，基因在遗传中具有完整性和独立性，随染色体的分离、配对而进行独立的分配。
2、核酸---遗传信息的载体
基因位于核酸分子上，所以核酸是遗传变异的物质基础，是遗传信息的载体，在蛋白质生物合成中起十分重要的作用。
二、核酸的化学组成1、分类---核酸分为RNA（mRNA、tRNA、rRNA）和DNA2、核酸中的糖---核糖和脱氧核糖
3、含氮碱基---嘌呤和嘧啶衍生物
4、核苷酸---核酸的基本结构单位,由碱基、戊糖和磷酸组成。
5、核苷酸的衍生物（1）ATP和GTP ATP：腺嘌呤核糖核苷三磷酸；GTP：鸟嘌呤核糖核苷三磷酸
（2）cAMP和cGMP 主要功能是作为细胞之间传递信息的信使。
6、核苷酸的重要作用
（1）核苷酸是合成DNA和RNA的前体
（2）在多糖合成中尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）是葡萄糖的活性形式，是合成糖原葡萄糖基的直接供体
（3）ATP是生物体内生物能生成、储藏、转运的中心
（4）各种代谢反应中所需要的NAD（H)、NADP（H）等都是腺苷酸的衍生物
（5）cAMP为3‘，5`-环腺苷酸，它是由ATP转变而来的，在生物体细胞内具有传递生理信息的重要作用，被称为第二信使。
（6）鸟嘌呤-5‘-三磷酸（GTP）是生物大分子移位反应的主要动力来源。
第二节 核酸的结构
一、核酸的一级结构
指核苷酸的排列顺序，包括核苷酸间的连接键
1、磷酸二酯键----核苷酸间的基本连接 核苷酸之间通过3`，5 `-磷酸二酯键连接
2、一级结构----核苷酸的排列顺序
二、核酸的高级结构
1、DNA的二级结构----双螺旋结构模型（1）DNA双螺旋结构模型提出的依据
主要依赖于20世纪40年代X射线衍射技术的应用，不少人 得到了
大量核酸X的衍射图谱。
（2）DNA双螺旋结构模型的特征
主链:两链均为右手螺旋，磷酸二酯键方向相反。
碱基配对
碱基参数：双螺旋直径2nm，相邻碱基对之间的高度即碱基垂直堆积距离为0.34nm.螺旋表面（形成大沟和小沟）（3）DNA双螺旋结构的稳定因素 氢键（AT间两个，GC间3个氢键）碱基堆积力（两个平行的碱基环之间）
离子键（磷酸基团的解离，使DNA成为一种多电荷阴离子，有利于与带正电荷的组蛋白或介质中的阳离子形成静电作用，利于双螺旋的稳定）
2、tRNA二级结构---三叶草结构模型 四臂四环 氨基酸接受区 反密码子区 二氢尿嘧啶区
TΨC区（一臂一环）可变区
3、DNA的三级结构---超螺旋
DNA的三级结构是指双螺旋基础上分子的进一步扭曲或再次螺旋所形成的构象。其中，超螺旋是最常见并且研究最多的DNA三级结构。
第三节 核酸的性质及纯度测定
一、核酸的溶解性
1、溶解性—碱基、核苷酸和核酸具有不同的溶解性
DNA和RNA都是极性化合物，一般都微溶入水，不溶于乙醇、乙醚。核酸、核苷酸、碱基在水中的溶解度依次减小。
2、0.14摩尔法---分离DNA蛋白质和RNA蛋白质
DNA蛋白的溶解度在低浓度盐溶液中随盐浓度的增加而增加，在1mol/LNaCI溶液中的溶解度比纯水中高2倍，但在0.14mol/的NaCl溶液中溶解度最低（几乎不溶），而RNA蛋白在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度较大，故可以在此盐浓度条件下分离DNA蛋白和RNA蛋白。
二、核酸的分离
1、多价解离—体内DNA呈多阴离子态（磷酸可解离成多价阴离子）。磷酸多级解离，多元酸；另外还含有含氮碱基，又呈碱性，所以核酸为两性电解质。
2、带电性—核酸和核苷酸可用离子交换分离
由于核酸、核苷酸是两性电解质，在一定pH条件下，如果核酸、核苷酸带正电荷，可用阳离子交换树脂进行分离，带电荷越多的核酸结合越牢固，最后被洗脱下来。
三、紫外吸收
1、紫外吸收—由碱基的共轭体系决定
由于嘌呤碱和嘧啶碱、核苷、核苷酸、核酸都在240-290nm范围内有特征吸收。通常选用260nm处测定
2、定量测定—核酸和核苷酸测定的基本方法
定性测定的几个数据判断：最大吸收波长、最小吸收波长、在两个吸收波长下吸光度比值(250/260、260/280>2.0，表示RNA样品中蛋白质含量低，>1.9表示DNA样品中蛋白质含量低。290/260）。
定量测定公式：核苷酸%=[(Mr×A260)/(ξ260×C)]×100 Mr为核苷酸相对分子质量； ξ260为在260nm处的吸收系数，C为样品浓度，mg/mL，A260为样品在260nm波长下的吸光度值。
对于大分子核酸的测定，常用比吸收系数法或摩尔磷原子吸收系数法。
比吸收系数ε是指一定浓度（mg/mL或ug/mL）的核酸溶液在260nm处的吸光度值。摩尔磷原子吸收系数ε（P）是指含磷浓度为1mol/L时的核酸水溶液在260nm处的吸光度值。
四、变性与复性
1、DNA变性---DNA生物功能实现所必需
变性：氢键、碱基堆积力等被破坏，双链成为单链的过程，但一级结构没有被破坏。变性因素：加热、极端的pH 条件、有机溶剂、尿素、甲酰胺等。
变性后的表现：由一定刚性变为无规则线团，DNA溶液的黏度降低，沉降速度加快，藏在内部的碱基全部暴露出来，DNA的A260增大，即增色效应。
2、DNA复性—核酸研究中的常用手段 复性的概念：
复性应用：变成单链再形成双链，用于DNA-DNA杂交。
五、核酸的含量与纯度测定
1、定磷法、定糖法—测定核酸含量
利用纯的核酸含磷元素的量为9.5%左右。用强酸消化核酸成无机磷酸，然后磷酸与定磷试剂中的钼酸铵反应生成磷钼酸铵，它在还原剂作用下被还原成钼蓝复合物，最后在650-660nm下比色测定，得出总含磷量，再减去无机磷（即不经硝化直接测定）的量即为核酸磷的真实含量，此值乘以系数10.5即为核酸含量。（2）定糖法
核酸分子含有核糖或脱氧核糖，这两种糖具有特殊的呈色反应。
RNA 在浓盐酸或浓硫酸作用下，RNA受热发生降解，生成的核糖进而脱水转化成糖醛，糖醛与3，5-二羟甲苯(苔黑酚)反应生成绿色物质，最后在670nm-680nm下比色测定。
DNA DNA受热酸解释放出脱氧核糖，后者在浓硫酸或冰醋酸存在下可与二苯胺反应生成蓝色物质，在595-620nm波长下进行比色测定。
定糖法的测定范围
苔黑酚法为20-250ugRNA，二苯胺法为40-400ugDNA.2、凝胶电泳---DNA纯度鉴定（1）紫外吸收法测定核酸纯度
利用测定260nm处和280nm处吸光度的比值来确定，纯DNA比值为1.8，纯RNA比值为2.0，在纯化DNA时，通常用比值在1.8-2.0之间作为纯度标准，大于此值表示有RNA污染，如果小于此值，则有蛋白质或酚等污染。（2）凝胶电泳法鉴定DNA纯度
琼脂糖凝胶电泳，目前分离纯化和鉴定核酸特别是DNA的标准方法。
DNA在琼脂糖凝胶中泳动率取决于：DNA分子大小、琼脂糖浓度、DNA构象及电流强度。
六、核酸碱基序列的测定
1、DNA碱基序列测定方法
（1）DNA碱基序列测定的基本步骤
DNA片段的制备（利用限制性内切酶和PCR方法）
DNA碱基序列测定
（2）Maxam-Gilbert（化学降解法）
原理是应用一定化学试剂，选择性的切断某种特定核苷酸（A、G、T、C）所形成的磷酸二酯键，得到不同链长的DNA小片段,包括两步：碱基选择性水解；对水解产物DNA小片段进行电泳分析和碱基序列的推测。（3）Sanger法（末端终止法）
原理是以DNA的酶促合成为基础，以被测DNA单链为模板，通过特殊设计的“末端终止技术合成出一系列相差一个核苷酸长度的互补链，然后利用凝胶电泳分离这些不同长度的DNA小片段，据此推测确定待测DNA链的碱基序列。（4）DNA的自动测序法
原理是以Sanger法为基础，主要改进是以荧光标记物代替同位素标记，即以不同颜色的荧光分别代表A、T、G、C四种碱基，电泳结果经激光束激发后，其最大的发射波长被转换成四种碱基含义的电信号，再由仪器的检测系统识别和记录。
2、RNA碱基序列测定方法 应用逆转录法，以待测的RNA链为模板，在逆转录酶催化下，合成DNA，然后用Maxam-Gilbert 法或Sanger法测定DNA碱基序列，再得出RNA的碱基序列。第四节
核酸的生物功能
一、DNA的复制与生物遗传信息的储存
DNA复制是保持生物种群遗传性状稳定的基本分子机制。
DNA复制理论为现代分子分子生物技术、如基因重组、聚合酶链式反应和基因突变技术等的发展奠定了理论基础和实验基础。
二、RNA是生物遗传信息表达的媒介
1、基因的转录—mRNA的合成是以DNA为模板合成与其碱基序列互补的mRNA的过程
2、tRNA和rRNA的功能
tRNA是将mRNA携带的遗传密码翻译氨基酸信息，并将相应的氨基酸活化后，带到核糖体上进行蛋白质合成。
rRNA是组成核糖体的主要组成，目前的作用机制还不清楚
3、核酸与蛋白质的生物合成关系
（1）tRNA对氨基酸的识别、结合和活化
tRNA在氨基酰-tRNA合成酶的作用下，能识别相应的氨基酸，并通过tRNA氨基酸臂3‘-羟基与氨基酸的羧基形成活化酯-----氨基酰-tRNA（2）氨酰-tRNA在mRNA模板指导下组装成蛋白质
氨基酰-tRNA通过反密码子臂上的三联体反密码子识别mRNA上相应的遗传密码，并将所携带的氨基酸按mRNA遗传密码的顺序安置在特定的位置上，最后在核糖体中合成肽链。
三、生物遗传变异的化学本质—DNA结构变化
碱基序列颠倒，某个碱基被调换，少了或多了一对或几对碱基
四、核酸的催化性质
1、核酶的组成和结构
核酶是具有特殊结构的RNA，RNA是核酶的功能部分，有些核酶除含有RNA外，还含有蛋白质等成分。
2、核酶的催化作用
核酶的催化反应包括水解反应、连接反应和转核苷酰反应等。
如核酶RNaseP在tRNA前体的5‘端部分水解切除一个特殊序列，生成tRNA.3、核酶的研究现状与展望
研究发现，核酶在翻译、表达和核糖体功能的实现中可能具有重要作用。
存在的问题：核酶的催化效率太低；由于核酶本身是RNA，很容易被核酸水解酶所破坏。展望：定向分子进化技术、PCR技术等的应用为筛选特殊性质的新型核酶开辟了新的途径。
第五节 核酸化学中的几种重要技术
一、核酸的分子杂交技术
原理：利用核酸（DNA）的变性和复性的性质。
二、PCR技术 聚合酶链反应的简称
三、基因定点突变技术
是应用人工的方法，合成在某一点或某几点上碱基序列改变的突变DNA，然后再通过突变DNA的转录、翻译和表达，获得突变蛋白质的技术。基因定点突变技术的关键是合成一种特殊的引物DNA。
四、定向分子进化
主要是通过DNA或RNA的突变、筛选和扩增的不断循环，从而获得具有优良性能的新品种分子。
第五章
重点
1、聚合酶链反应（PCR）技术的原理和操作步骤
2、从tRNA的结构上，如何理解它在蛋白质翻译过程中的作用？
3、核酸的含量与纯度测定的方法和原理如何？
4、紫外吸收法测定核酸的原理是什么？
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