分子生物学实验教案,大纲,目录_分子生物学实验教案

2020-02-25 教案模板下载本文

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分子生物学实验室实验目录

实验1 质粒DNA的提取、酶切与电泳

实验2 大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化实验3 聚合酶链式反应扩增DNA片段实验4 植物基因组DNA提取及电泳实验5 植物RNA提取及电泳实验6 RT-PCR技术

实验7 外源基因在原核细胞中的表达及分析实验8 DNA重组体的构建与筛选

《分子生物学实验》教学大纲

英文名称： Molecular Biology Experiments 学分：1 学时：32 教学对象：生物工程专业、生物科学专业、生物技术专业

教学目的：在开设的理论课程的基础上，结合实验课程的教学，使学生能较全面系统的掌握分子生物学的基本操作，拓宽专业知识面，加深对专业知识的理解，强化动手能力。

基本要求：了解分子生物学的实验操作原理，掌握有关实验仪器的使用方法。实验内容：

实验1.质粒DNA的提取、酶切与电泳（8 学时）基本要求: 通过学习碱变性抽提法对大肠杆菌中的质粒的抽提，掌握质粒DNA 的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA 的原理。进一步了解限制性内切酶的特性及酶切反应过程，掌握DNA 的酶切技术。

重点: 掌握质粒DNA 的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA 的原理。进一步了解限制性内切酶的特性，掌握DNA 的酶切技术。难点: 掌握质粒DNA 的小量制备方法及DNA 的酶切技术。

实验2.大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化（4 学时）基本要求: 了解细菌基因组DNA 的提取的目的，原理，掌握细菌基因组DNA 的提取的实验步骤及操作方法重点: 掌握细菌基因组DNA 的提取的实验步骤及操作方法难点: 掌握细菌基因组DNA 的提取的实验步骤及操作方法实验3.聚合酶链式反应扩增DNA片段（4 学时）基本要求: 了解大肠杆菌感受态细胞的制备原理及转化反应的目的，应用范围及操作过程，掌握重组DNA 质粒转化大肠杆菌的操作技术。重点: 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的操作技术难点: 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

实验4.植物基因组DNA提取及电泳（8 学时）基本要求: 熟悉聚合酶链反应（PCR）的基本原理、实验基本条件；了解 PCR 反应条件的优化和注意事项和应用范围掌握聚合酶链反应（PCR）的实验技术：了解核酸琼脂糖凝胶电泳的原理及操作步骤，掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法。重点: 掌握掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法。难点: 聚合酶链反应（PCR）的实验技术，琼脂糖凝胶电泳的实验方法。实验5.植物RNA提取及电泳（4 学时）基本要求: 学习从植物组织中提取总RNA的方法，了解RT-PCR的基本原理和实验方法。重点: 掌握从植物组织中提取总RNA的方法，了解RT-PCR的基本原理和实验方法的基本步骤及实验结果的判定难点: 凝胶电泳的实验步骤及实验结果的判定实验6 RT-PCR技术基本要求：

1、学习基因特异性引物的设计。

2、学习和掌握RT-PCR的原理和方法。

3、学习和掌握用半定量RT-PCR对基因表达水平进行相对定量的原理和方法。重点：如何选择需要检测的目的基因难点：目的基因特异性引物的设计。2 基因表达差异的分析。

实验7 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用基本要求：

1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。重点: 掌握外源基因在原核细胞中表达方法难点: 乳糖操纵子的调节机制和操作方法实验8 DNA重组体的构建与筛选目基本要求：重点：

已转化的感受态细胞涂板培养，观察难点：阳性克隆目的基因DNA分子的鉴定学习和掌握细菌转化与目的基因DNA分子增殖及其鉴定的原理和方法。实验1大肠杆菌感受态细胞的制备与DNA质粒转化

实验目的掌握重组DNA 质粒转化至大肠杆菌宿主的操作技术。

实验原理

带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。

大肠杆菌形态图

实验步骤感受态细胞的制备： 1)挑菌37℃培养。

2)将过夜培养的细菌转接培养2-3 小时。

3)将菌液置冰上10 分钟，4℃离心8000rpm 30 秒。4)用氯化钙溶液悬浮菌体，冰浴，离心弃去上清。5)氯化钙溶液悬浮菌体。2 转化：1)取出感受态细胞,试剂A，无菌双蒸水和待转化的质粒DNA，均置冰盒内。2)取离心管管一支，将质粒、试剂A、无菌水，感受态细胞混匀冰浴20 分钟。3)在管内加入400ul LB 液体培养基，振荡培养10-40 分钟。4)涂布培养。

实验2 质粒DNA 限制性内切酶实验

实验目的通过DNA 限制性内切酶实验掌握内切酶技术。

实验原理

不同酶切反应都需要不同的酶切缓冲液。多数生物技术公司的产品目录中均有关于何种限制性内切酶适合何种缓冲液的资料可供查阅。绝大多数酶的反应温度是在37℃。酶切反应时间有30 分钟、60 分钟，以至2 小时以上甚至过夜。本次实验要进行的是对重组质粒pET-22b 进行EcoRI 酶切，重组质粒上有两个 EcoRI 识别位点。

内切酶酶切DNA 示意图内切酶酶切DNA 立体示意图琼脂糖凝胶电泳图

实验步骤在离心管管中以编号次序加入以下相应试剂：（1）ddH20 45μl 6（2）10×Buffer 2μl（3）BSA 小牛血清 25μl（4）质粒DNA 10μl（5）EcoRⅠ 1μl 总体积 20μl 2 37℃水浴15 小时后，终止酶切反应。3 取单酶切反应液10μl 和上样缓冲液2μl，混匀，标准分子量DNA 5μl，待作电泳上样液。4 08%的琼脂糖凝胶电泳。紫外灯下观察酶切琼脂糖凝胶电泳图。

实验3 基因组DNA的PCR扩增

实验目的学习PCR 反应的基本原理与实验技术。

实验原理

多聚酶链式反应的原理类似于DNA 的天然复制过程。在待扩增的DNA 片段两测和与其两测互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸后，DNA 可扩增一倍。

PCR 反应的原理琼脂糖凝胶电泳图

实验步骤在02ml 离心管管内配制50μL 反应体系：（1）ddH2O 38μL（2）10×buffer 5μL（3）dNTP 1μL（4）Taq 酶 1μL（5）引物P1 1μL（6）引物2 1μL（7）模板DNA 3μL 2 按下列程序进行扩增：

（1）94℃预变性5 分钟；（2）94℃变性50 秒；（3）55℃退火50 秒；（4）72℃延伸10 秒；（5）重复步骤②-④30 次；（6）72℃彻底延伸10 分钟。3 琼脂糖凝胶电泳分析PCR 结果。

实验4 植物基因组DNA提取

实验目的掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

实验原理

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后 8 即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

仪器、材料、试剂

(一)仪器 1．高速离心机 2．烘箱

3．冰箱 4．水浴锅 5.高压灭菌锅

（二）材料

1．十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)2.三羟甲基氨基甲烷（Tris）3．乙二胺四乙酸（EDTA）4.氯化钠 5．2-巯基乙醇 6.无水乙醇 7.氯仿 8.异戊醇

（三）试剂

1.CTAB抽提缓冲溶液: 250ml

配制方法：称取CTAB 4g，放入200 ml的烧杯，加入5 ml的无水乙醇，再加入100 ml的三蒸水，加热溶解，再依次假如56 ml的5moll NaCl、20 ml 的1 moll Tris-HCl 20ml(PH8.0)、8ml 的0.5 mol/l EDTA定容至250 ml摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温, 冷却后加入2ml的1% 2-巯基乙醇（400ul），4℃保存。

2.氯仿:异戊醇=24：1（配制方法如实验二）3．TE缓冲液: PH8.0（配制方法如实验二）

实验步骤

(一)DNA的提取

1.2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热； 2.取少量叶片置于试管中，用小杵磨至粉状； 3.加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动摇匀；4.置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；

5.冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇(24:1)至满管，振荡2~3 min，使两者混合均匀； 6.10000 rpm离心10 min，与此同时，将600 μl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中； 7.10000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物； 8.10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出 9.加入800 μl 75%的乙醇，将DNA洗涤 30 min；

10.10000 rpm离心30s后，立即倒掉液体，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）； 11.加入50 μl 0.5 × TE缓冲液，使DNA溶解； 12.置于-20℃保存、备用。

注意事项

1.叶片磨得越细越好。2.注意移液器的正确使用。

3.由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

实验5植物总RNA的提取及RT-PCR

一、实验目的

1.学习从植物组织中提取总RNA的方法 2.了解RT-PCR的基本原理和实验方法

二、实验原理

1.RNA提取的原理

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

2.RT-PCR的原理

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）作引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cDNA探针等。

三、仪器、药品与试剂配方

(一)仪器及器皿

1．低温离心机； 2．琼脂糖凝胶电泳系统； 3．高压灭菌锅； 4.PCR仪；

5．研钵；

6.一次性手套等；

7.离心管；

8.培养皿；

9.烧杯及试剂瓶等。(二)药品

1.焦碳酸二乙酯(DEPC)

2.异硫氰酸胍(GT)

3.醋酸钠(NaAc)4.苯酚

5.异丙醇

6.氯仿 7.乙醇

8.β－巯基乙醇

9.琼脂糖

10.MLV反转录试剂盒

11.Taq DNA聚合酶

12.引物(三)试剂配制

1． 0.1% DEPC水

灭菌 2.4 mol/L异硫氰酸胍

3.2 mol/L NaAc（pH 4.8）灭菌 4.3 mol/L NaAc（pH 4.8）灭菌 5.4 mol/L LiCl 灭菌

6.1×TE缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH8.0），1 mM EDTA（pH8.0）, 灭菌。

四、实验步骤

（一）总RNA的提取

（1）研钵冷却后，倒入2/3液氮，加入0.2 g植物材料，充分研磨后转入一个含有300 l的4M GT的1.5 ml的聚丙烯管中，摇匀。

（2）加入30 l 2 M NaAc（pH4.9-5.2）摇匀，加入300 l酸酚（水饱和酚pH

（3）12000 rpm 4℃离心20 min，吸取上清，加入等体积异丙醇，于冰上放置15 min。（4）12000 rpm 4℃离心10 min，将沉淀悬浮于含100 l 4M氯化锂的1.5 ml EP管中，于-20℃放置1小时或更长时间。

（5）12000 rpm 4℃离心10-15 min，将沉淀溶于0.4 ml DEPC水中，加入1/2体积氯仿和1/2体积酸酚，摇匀，进行抽提，12000 rpm 4℃离心5 min；上清加入等体积氯仿，摇匀，进行抽提，12000 rpm 4℃离心5 min。

（6）上清液加入1/10体积的3 M乙酸钠和两倍体积的无水乙醇于-20℃放置1小时或更长时间。

（7）12000 rpm 4℃离心15 min，超净台吹干，沉淀溶于10 l b灭菌的DEPC水中。（8）RNA贮于-80℃。

（二）RNA反转录产生cDNA 在DEPC处理过的离心管中冰上按下表加入：

模板RNA 2 µl Olig(dT)18 1 µl DEPC 水 2 µl 混匀，70℃水浴中放置2 min，立即放置到冰上2 min。然后在冰上依次加入：

RNasin 0.5 µl M－MLV 1 µl 5×buffer 2 µl 10 mM dNTP 1.5 µl 42℃，水浴中反应90 min。72℃，10 min，终止反应。加入15 µl的DEPC灭菌水，使总体积达到25 µl。(三)PCR 1.在灭菌的PCR管中加入以下成分，形成PCR反应体系 10 X buffer

2.5 µl 11 dNTP(2.5 mmol)2 µl RT-PCR产物 5 µl Taq酶 0.5 µl 上游引物（10 µmol/l）0.5 µl 下游引物（10 µmol/l）0.5 µl 灭菌ddH2O加到25 µl 2.按照下列条件进行PCR反应 94℃ 5 min 94℃ 30 s 55℃ 30 s 72℃ 1 min 30个循环

72℃ 7 min 4℃

（四）电泳检测

将加EB的1 %变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加1×TE电泳缓冲液，覆盖凝胶约1 mm。将RNA及DNA样品加到凝胶点样孔中，85 V条件下电泳30 min，在紫外灯下观察结果。

五、注意事项

1．在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。

2．RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套。

3.使用DEPC时，应在通风橱中戴手套操作。4．RNA提取用品准备：

1）普通的玻璃器皿：180℃烘干8小时（玻璃），研钵，小勺，试剂瓶若干个。2）一次性使用的塑料制品：枪头、EP管等先用DEPC水处理然后高压灭菌，烘干。3）电泳槽：去污剂洗干净，水冲洗，3%H2O，0.1%DEPC水彻底冲洗。4）用烘烤过的药勺称取试剂。

5）用DEPC水配制试剂：0.1%DEPC水：37℃至少处理12小时，高压灭菌15min。6）含有Tris一类的缓冲液，不可用DEPC处理。

实验6 半定量RT-PCR检测基因的表达差异

授课题目：半定量RT-PCR检测基因的表达差异（设计、创新）（9学时）授课对象：生科系大三学生授课教师：教学目标及基本要求：

1、培养学生的创新意识和创新能力。

2、在任课教师的指导下，查阅资料，选题，开题，实施实验，最后以小论文的形式总结实验。

3、学习基因特异性引物的设计。

4、学习和掌握RT-PCR的原理和方法。

5、学习和掌握用半定量RT-PCR对基因表达水平进行相对定量的原理和方法。

6、采用开放性实验教学。教学内容提要及时间分配：

1、实验讲解： 查阅资料及选题 10分钟 拟定实验提纲 2分钟 准备实验 2分钟 实施实验 10分钟

以组织或细胞总RNA中的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，以Oligo(dT)或特异的下游引物合成与mRNA互补的cDNA片段。

所有合成cDNA的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3'端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。

基因表达调控研究及其它研究中，常需要对基因表达的水平进行定量比较，因此在RT－PCR技术的基础上又发展了定量PCR。这种方法需要选择一个合适的内对照。由于PCR是一指数扩增过程，逆转录及扩增效率的很小差异就会导致扩增产物量的较大差异，以致定量不准确。影响逆转录的因素有核苷酸序列的差异、ploy(A)尾的长度、PCR引物与poly(A)尾之间的距离等。影响PCR扩增效率的因素有模板、引物、dNTP、MgCl2、DNA聚合酶以及循环次数等，这些参数较易控制，另外还有引物结合效率的问题，不同的引物具有不同的结合效率，它们可相差105倍，因此，进行定量PCR时要选用同一引物。

实验报告的写作 2分钟

2、实验试剂与器材 2分钟

3、总结 2分钟教学重点及难点：

1、如何选择需要检测的目的基因。

2、目的基因特异性引物的设计。

3、基因表达差异的分析。教学方法：

采用启发式教学，结合理论，对实验步骤进行分析并给于适当示范。教学手段（挂图、幻灯、多媒体„等）：板书，PPT。使用的教材及参考资料：

1、《现代生物学实验》，熊大胜主编，中南大学出版社，20052、《分子生物学实验指导》，魏群主编，高等教育出版社，20063、《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克等著金冬雁、黎孟枫等译科学出版社 1999 思考题：

半定量RT-PCR对基因表达水平进行相对定量的原理和方法

本单元教学总结（教学的主要经验、效果、存在的问题、改进措施等）

1、结合理论内容讲述实验内容，采用开放性实验教学，效果较好。

2、采用开放性实验教学。

实验7 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用

实验目的1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。实验原理

1.外源基因在原核细胞中的表达

蛋白质通常是研究的最终目标，因此蛋白质的表达在基因工程中占有非常重要的地位。常用的表达系统有原核细胞和真核细胞。原核细胞表达系统主要使用大肠杆菌，真核细胞表达系统主要有酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。这些表达系统各有优缺点，应根据实验目的和实验室条件加以选择。本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。（1）大肠杆菌表达系统的特点：

生物学特性和遗传背景清楚，易于操作；

已开发较多的克隆载体可供选择；

容易获得大量的外源蛋白（外源蛋白可占细菌总蛋白50％左右）。（2）蛋白质在原核细胞中的表达特点：

原核细胞有其固有的RNA聚合酶，识别原核基因的启动子。因此，在用原核细胞表达目的基因（无论是真核基因还是原核基因）时，一般应使用原核启动子。

原核基因的mRNA含有SD序列，启动蛋白质的合成。而在真核基因上则缺乏该序列。因此，一些商品化原核表达载体上设计有SD序列，以方便真核基因的表达。

原核细胞没有mRNA转录后加工的能力。因此，在原核细胞中表达真核基因时，应使用cDNA 14 为目的基因。

原核细胞缺乏真核细胞对蛋白质进行翻译后加工的能力。如表达产物的功能和蛋白质的糖基化、高级结构的正确折叠有关，必须慎重使用原核表达系统。

外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在胞浆聚集，形成均一密度的包涵体。包涵体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性，往往需要通过变性复性的方法恢复活性，有时只能回复部分活性。（3）蛋白质在原核细胞表达的调控

启动子是转录水平调控的主要因素。根据启动子起始mRNA合成效率的不同，可分为强、弱启动子，但是启动子的强弱是相对于不同基因而言的。有些启动子的活性可以通过物理或化学的方法诱导调控。在基因工程中，原核表达系统通常采用可调控的强启动子。常用的原核启动子有：由异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的lac启动子，由3-吲哚乙酸（IAA）诱导的trp启动子，由温度诱导的PL和PR启动子等。噬菌体 T7 RNA聚合酶启动子是一个很强的启动子，近年来在原核表达中得到广泛应用。

SD序列是原核表达中翻译水平的重要调控因素。SD序列和16S RNA3′端的互补程度、SD序列和目的基因间的距离在很大程度上影响蛋白的合成量。（4）蛋白质在原核细胞中的表达形式

外源基因在原核细胞中可以以非融合蛋白、融合蛋白和分泌型表达等不同形式进行表达。具体要根据表达产物使用的目的和操作方法进行选择。

非融合蛋白使用的外源基因必须具有从起始密码子到终止密码子的完整读框。非融合蛋白的一级结构和天然蛋白质相同，是一些体内应用基因工程产品的必要条件。但是非融合蛋白在原核细胞内不稳定，易被降解，而且不易纯化。

融合蛋白指的是在表达产物的N端或C端具有非目的蛋白的氨基酸残基。融合蛋白使用的外源基因，必须注意其读框和载体上原核读框相符和。融合蛋白在大肠杆菌内较稳定，不易被降解。而且，作为融合蛋白一部分的原核多肽往往是用于纯化，或是作为检测该融合蛋白的“标签（tag）”。如本实验中采用金属螯合亲和层析技术纯化带6个His标签的融合蛋白。

分泌型表达指的是在细胞浆内合成的多肽进入内膜和外膜的周间质。进行分泌型表达时，要将一段原核或真核的信号肽序列连接在待表达基因的上游。常用的信号肽有ompT、phoA、pelB等，在表达的蛋白进入细胞周间质时，信号肽被蛋白酶水解，产生游离的表达产物。因此，分泌型表达可以保护外源蛋白不被细胞内的蛋白酶降解，增加表达产物的稳定性，同时，表达蛋白的生物活性较好，易于纯化，但是，表达量往往比较低。2.乳糖操纵子的调节机制操纵子是原核细胞基因表达的协调单位。通常由两个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成。

乳糖操纵子的调节包括乳糖（或IPTG）的诱导效应和葡萄糖的降解物阻遏效应。（1）乳糖操纵子的诱导表达

当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使目的基因（本实验中目的基因为绿色荧光蛋白基因）不能转录，也就不能翻译出目的蛋白。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态。

当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3′端移动，于是，结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操纵子被诱导（如图3）。

乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解，它的诱导作用是持久的。

（2）乳糖操纵子的降解物阻遏

当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只有当葡萄糖耗尽后，细菌才能充分利用乳糖，这种现象称葡萄糖效应，其实质是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又称降解物阻遏（catabolic repreion）。

降解物阻遏的机理：代谢物基因激活蛋白（Catabolite gene Activation Protein，CAP），又称cAMP受体蛋白（cAMP Receptor Protein，CRP），属于一种激活蛋白，对乳糖操纵子进行正调节。CAP分子内同时具有DNA结合区和cAMP结合区。当CAP与cAMP结合后，就可结合到CAP结合位点上，促进转录。葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP的浓度，抑制转录。（3）阻遏蛋白负调节与CAP正调节的协调

当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；而没有CAP存在时，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。只有在CAP存在且没有阻遏蛋白与操纵序列结合时，或者说只有高乳糖低葡萄糖时，操纵子发挥最大转录活性。这种协调与细菌对碳源的优先利用相一致。

本实验使用的表达载体p32aGFPuv上含有乳糖操纵子的调节序列，目的基因表达的是带6XHis（组氨酸标签）的重组绿色荧光蛋白。在IPTG的诱导下，融合蛋白表达可增强105倍，并且可用金属鳌合亲和层析分离纯化，最终获得纯的重组绿色荧光蛋白。试剂与器材

（一）试剂

1.LB 液体培养基 2L 2.10mg/mL氨苄青霉素溶液 10mL（全班共用）3.100 mmol/L IPTG溶液 10mL（全班共用）4.20%葡萄糖溶液 10mL（全班共用）

5.超声平衡缓冲液：50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl pH7.0 500mL

（二）器材

超净工作台、恒温振荡器、台式高速离心机、高速冷冻离心机、低温摇床、高压破碎仪或超声破碎仪等。

（三）菌株

工程菌BL21(DE3)pET-32a和工程菌BL21(DE3)p32aGFPuv。【操作方法】

1.分别挑取工程菌BL21(DE3)pET-32a和BL21(DE3)p32aGFPuv的单菌落接种到5mLLB液体培养基（含氨苄，终浓度为100μg/mL，以下同）。

2.于37℃、250r/min培养过夜（12h－14h）至对数生长期。

3.取三支灭菌试管，各加入5mL LB液体培养基(含氨苄），分别编号为1#，2#，3#，另外取装于500mL三角瓶中的150mL LB液体培养基（含氨苄），编号6#，全部按1：50的比例接种。1# 接种100μL BL21(DE3)pET-32a，2# 接种100μL BL21(DE3)p32aGFPuv，3# 接种100μL BL21(DE3)p32aGFPuv，6# 接种3mL BL21(DE3)p32aGFPuv。4.于37℃、250r/min培养约2h－3h。

5.诱导处理：1#、2#不需处理；3#加入20％葡萄糖100μL至终浓度为0.4％，加入5μL 100mmol/L IPTG至终浓度为0.1mmol/L；6#加入100mmol/L IPTG约150 μL至终浓度为0.1mmol/L。6.于21-25℃、250r/min培养约10h－12h或过夜。

7.收菌（注意采集标本并编号）：①从6#三角瓶培养的150mL菌液中取出5mL置于一支试管中（编号为4#）。②分别从1#，2#，3#培养物各取100μL于EP管用于SDS-PAGE。③将1#，2#，3#，4#试管中的菌液分别收集到4个1.5mLEP离心管中，编上相应编号。1#，2#，3#离心弃上清；4#上清收集到另一个EP管，编号为5#。④6#三角瓶中剩余菌液用 50mL离心管于5000r/min，4℃，离心10min，弃上清收集菌体。

8.于紫外灯下观察1#-5#管收集的菌体或上清液，观察哪支管有荧光（荧光强弱），记录观察到的现象，并拍照。

9.6#收集的全部菌体用50mL超声平衡缓冲液重悬（50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl pH7.0)。10.超声波破菌或高压破菌，然后用50mL离心管于8000r/min，4℃，离心40min，取上清（弃沉淀）。上清可保存于-20℃冰箱，作下一步亲和层析实验用。

超声操作：冰浴下进行，功率为400W，工作4s，间隙4s，为一次，99次为一周期。共处理六周期。

高压破碎操作：压力约为150MPa。注意根据裂解液浑浊程度控制流速，1drops/1~4seconds。【注意事项与提示】

1.本实验的目的是比较重组DNA在大肠杆菌中表达时是否受IPTG和葡萄糖存在的影响，所以1#、2#管的细菌在25-28℃培养时不加IPTG和葡萄糖，3#管除加IPTG外还加入葡萄糖，糖的浓度要大于0.2%以上（本实验采用0.4％）。4#三角瓶细菌仅加IPTG 也仅指这次实验所用的重组DNA菌体而言。有的重组DNA菌体在其表达时除需加IPTG外仍需加入少量的葡萄糖为碳源作诱导。在转管培养及收菌时要注意各管编号要相应对好，不能混乱。

2.不同的重组DNA在不同的宿主菌中蛋白的表达量往往受到IPTG浓度和温度的影响，最好采用不同温度或不同浓度的IPTG来诱导，观察哪种温度或哪种浓度条件下其蛋白表达量最大。在科研中一般都要求这样做。

3.由于本实验所表达的目的蛋白带有绿色荧光蛋白，其在大肠杆菌中有很强的荧光。离心后收集的菌体在紫外线的照射下都可见黄绿色荧光，所以把1#、2#、3#、4#沉淀菌体放在紫外灯下观察其是否有荧光及其荧光的强弱，就可判断其是否有表达及其所表达的强度。【实验安排】

1.第一天晚上9时左右活化种子菌。

2.第二天上午配制培养基及灭菌，下午至晚上做放大接菌和诱导。3.第三天上午收菌、观察、拍照、破碎菌体、离心收集蛋白。

实验8 DNA重组体的构建与筛选目

授课题目：目的基因的克隆与鉴定（12学时）授课对象：生科系大三学生授课教师：教学目标及基本要求：

1、学习和掌握细菌转化与目的基因DNA分子增殖及其鉴定的原理和方法。

2、采用开放性实验教学。教学内容提要及时间分配：

1811、实验原理讲解： 8分钟 转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，得了外源DNA的细胞称为转化子 感受态细胞 基因克隆 阳性克隆的鉴定

2、实验试剂与器材 2分钟

3、实验步骤讲解： 10分钟 用碱裂解法提取质粒DNA  PCR产物的检测与回收

质粒DNA与目的基因DNA分子的连接 获得转化的感受态细胞