生化实验教案_生物化学实验教案全
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生命科学与技术学院生化实验（下）
生 物 化 学 实 验（下）
实验三 离子交换柱层析法分离氨基酸
生命科学与技术学院生化实验（下）
华中科技大学生命科学与技术学院 2012级生物化学小老师
第三组
离子交换柱层析法分离氨基酸
【实验目的】
1.学习离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。2.掌握离子交换柱层析的基本操作。3.掌握氨基酸和茚三酮显色机理。
【实验原理】
1.离子交换层析原理
离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离目的的方法。
有些高分子物质含有一些可以解离的基团，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应，如：
或
这类高分子物质统称为离子交换剂，离子交换剂是一类具有离子交换功能的高分子材料。功能基团由固定在骨架上的带电基团与可进行交换的能移动离子两部分组成，二者所带电荷相反，以静电作用结合。可进行交换的离子称为反离子或抗衡离子，这种反离子可与溶液中带
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同种电荷的离子进行交换反应。因离子交换反应是可逆的，在一定条件下被交换的离子也可以“解吸”，使离子交换剂又恢复到原来的离子形式，所以离子交换剂通过交换和再生可以反复使用。其中使用的最普遍的是离子交换树脂。由于一定离子交换剂对于不同离子的静电引力不同，因此在洗脱过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后完全分离。
选择适当的条件，可使一些溶质分子变成离子态，通过静电作用结合到离子交换剂上，而另一些物质则不能被交换，这两类物质即被分离。带同种电荷的不同离子都可以结合到同一介质上，但由于各自所带电量不同，与介质的结合牢度不同，可改变洗脱条件使它们依次先后被洗脱，从而达到分离目的。
离子交换层析是一种基于氨基酸电荷行为的层析方法。本实验采用磺酸型阳离子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI2.97）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI9.74）的混合液。氨基酸是两性电解质，分子上所带的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值。在pH5.3条件下，因为pH值低于Lys的PI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。在pH12条件下，因pH值高于Lys的pI值Lys可解离成阴离子从树脂上被交换下来。这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。2.茚三酮反应机理
茚三酮反应是指在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色（与羟脯氨酸或脯氨酸反应生成（亮黄色）化合物的反应。
该紫色化合物在570nm处有最大光吸收，所以可以利用分光光度计测量其含量。
由于该反应灵敏度高，目前已经广泛应用于氨基酸定性和定量的分析，国内的大部分教材认为其反应机理为：
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但是大量实验表明而且大部分的学者认为茚三酮显色反应生成的有色物质是混合物而不是单一组分。
茚三酮显色反应受pH，茚三酮试剂的配制方法和浓度，氨基酸种类和浓度，反应温度，反应时间，冷却时间，离子强度等都有较大影响。特别要注意的是pH对显色反应的影响特别大，且该反应在一个小时内稳定。
【实验器材和试剂】
一、实验器材
层析柱（20cm*1cm）；铁架台；恒流泵；部分收集器；分光光度计；移液枪；恒温水浴锅；试管；玻璃棒；烧杯；试管架。
二、实验试剂
①732型阳离子交换树脂（100-200目）
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②2mol/L氢氧化钠溶液，1mol/L氢氧化钠溶液； ③2mol/L盐酸溶液，0.1mol/L盐酸溶液； ④标准氨基酸溶液
天冬氨酸、赖氨酸均配制成2mg/mL的0.1mol/L盐酸溶液； ⑤洗脱液
柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲溶液（pH5.3）
取柠檬酸14.25g，氢氧化钠9.30g和浓盐酸5.25mL溶于少量水后，定容至500mL，冰箱保存
注：在柠檬酸缓冲液中加入0.1%酚溶液可防止长霉。在室温较高的夏季，配制缓冲溶液用的蒸馏水必须是新鲜蒸馏水，配前煮沸，配好后在4℃保存。0.01mol/LNaOH溶液（pH12）
取0.4gNaOH固体用适量蒸馏水溶解后，定容至1L ⑥显色剂
取0.5g茚三酮溶于75mL乙二醇单甲醚中，加水定容至100mL。待测样品
混合氨基酸溶液：将2mg/mL天冬氨酸、赖氨酸溶液按1:2.5的比例混合，混合后再以1:1的比例用0.1mol/L盐酸溶液稀释。
【操作步骤】
1.树脂的处理
对于市售干树脂，先是经水充分溶胀后，经浮选得到颗粒大小合适的树脂，然后加4倍量的2mol/LHCl溶液浸泡1小时，倾去酸液，用蒸馏水洗至中性，然后用2mol/LNaOH溶液处理，做法同上。以1mol/LNaOH溶液浸泡树脂一小时转化为钠型，用蒸馏水洗至中性，最后用欲使用的柠檬酸缓冲液浸泡，过剩的树脂浸入1mol/LNaOH溶液中保存，以防细菌生长。2 装柱
取层析柱一支，垂直固定在铁架台上，(实验前需进行检漏，小老师会在实验过程中进行演示)用夹子夹紧柱底出口处橡胶管，在柱内加2~3cm高的柠檬酸缓冲液。将搅拌成悬浮状的树脂沿柱内壁缓慢倒入。待树脂在柱底部逐渐沉降时，慢慢打开柱底出口处铁夹，继续加入树脂悬浮液，直至树脂高度到层析柱高度的3/4处。
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注意：要注意装柱过程的连续性，装好的层析柱应均匀，防止产生气泡，节痕或界面，否则会对实验有较大的影响，必须重新装柱。3 平衡
层析柱装好后，再缓慢沿管壁加入 适量缓冲液至树脂床面以上2~3cm处，接上横流泵，用柠檬酸缓冲液以0.5mL/min的流速进行平衡，用pH试纸测量流出液pH，直至流出液的pH与缓冲液的pH相等。
注意：调节流速前要排除恒流泵与柱间连接管内所有气泡，以免影响流速，影响实验效果。调节流速时统一将流速调节为10滴/min,平衡时间一般为15分钟。4加样
关闭恒流泵，打开层析柱上端管口，缓慢打开柱底出口，小心放出层析柱内的液体至柱内液体的凹液面恰好与树脂上液面相齐，立即关闭下端出口（注意：不要使液面下降至树脂表面以下）。用移液枪吸取氨基酸混合样品0.5ml，沿靠近树脂表面的管壁缓慢加入，注意不要冲坏树脂表面。加样后打开柱底止水夹，使液体尽可能缓慢地流下至液体凹液面恰与树脂表面相平，立即关闭止水夹。再用胶头滴管吸取0.5ml缓冲液清洗柱内壁，打开止水夹放出液体，使液体下表面与树脂表面相平，按照此法清洗2次。然后小心加入缓冲液离柱顶部1cm为止，并将层析柱与恒流泵和部分收集器相连。
注意：样品体积不要过大，样品的含量不能超过层析柱内离子交换能力，否则影响分离效果。5.洗脱
① 缓冲液洗脱：用柠檬酸缓冲液（pH5.3）以6s/滴的流速开始洗脱，用试管收集洗脱液，每管收集1ml，收集1-10号管。(② 0.01mol/L NaOH溶液（pH12）洗脱：关闭恒流泵和止水夹，将柠檬酸缓冲液更换为0.01mol/L的NaOH溶液，打开止水夹进行洗脱，同法收集11-40管。收集完毕后，关闭止水夹和恒流泵。
注意：在整个实验过程中要多注意层析柱，避免使柱内液体流干，否则实验即为失败。6.测定
分别向60管收集液中加入1.5ml柠檬酸缓冲液，混匀后再加入1ml茚三酮显色剂，混匀。沸水浴15min后取出，冷却至室温，在1h内用分光光度计在570nm下以蒸馏水为空白管进行比色，测定各管的吸光度值。
注意：比色时尽量避免将液体沾在手上或衣服上。7.树脂再生
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层析柱使用几次后，需将树脂取出用1mol/LNaOH溶液洗涤，再用蒸馏水洗至中性后可反复使用。
注意：在本次实验结束之后需将树脂倒至指定烧杯中。
【结果与分析】
以吸光度值为纵坐标，收集的管数为横坐标，绘制出洗脱曲线。以已知两种氨基酸的纯溶液样品，按上述方法和条件分别操作，将得到的洗脱曲线与混合氨基酸的洗脱曲线对照，可确定2个峰的大致位置及各峰为何种氨基酸。
【思考题】
1.对于新树脂我们做的处理是先用2mol/LHCl搅拌半小时，然后用蒸馏水洗至中性，再用2mol/LNaOH搅拌半小时，用蒸馏水洗至中性，最后用1mol/LHCl搅拌半小时，还用蒸馏水洗至中性。请分析原因。
2.所加树脂的高度为层析柱高度的3/4，请思考树脂过高或过低对实验结果有何影响，试分析原因。
3.本实验加的样品为天冬氨酸和赖氨酸，若再加一个组氨酸，请估计其峰值的位置，说明理由。
