2结核分枝杆菌教案_结核分枝杆菌病例分析
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程名称：临床微生物学检验 NO：2 授课班级 12检验4、5班 授课日期 2014.2.27-28 授课教师
模块三,临床细菌学
学习任务二 第14章 分枝杆菌、放线菌与诺卡菌 【学习目标】
1.掌握结核分枝杆菌的基本特性及实验室检查方法 2.熟悉结核分枝杆菌的临床意义 3.了解分枝菌属的分类 【教学重难点】
重点：结核分枝杆菌的基本特性及实验室检查方法 难点：实验室检查方法 【教学方法】 讲授+自主+讨论 【导入新课】
复习前面的内容、提问及一些关于结核杆菌的故事，临床上对结核病的检测依据是是什么，通过什么样的检查才能尽快尽早对病情进行临床诊断，这就是我们今天要学习的内容。【教学内容】
第14章 分枝杆菌 放线菌与诺卡菌 概 述
分枝杆菌与放线菌属放线菌目（Actinomycetates）
分枝杆菌属（Mycobacterium）是一类细长略带弯曲专性需氧性杆菌。该菌一般认为革兰染色阳性。多数细菌在生长的一定时期抵抗酸-醇（acid-alcohol-fast），故又称抗酸杆菌（acid-fast bacillus）
放线菌（Actinomyces）是一群在生物学特性上与细菌类同的原核细胞型微生物，与分枝杆菌、棒状杆菌等有着亲缘关系
放线菌是多数不致病，对人致病的主要有放线菌属和诺卡菌属。
前者为厌氧或微需氧菌，细胞壁中不含分枝菌酸，多引起内源性感染。
后者为需氧菌，细胞壁中含有分枝菌酸，非人体正常菌群的成员，常引起外源性感染。
第一节 结核分枝杆菌
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）简称结核杆菌、人和动物结核病的病原菌
一、分 类 MTB包括
人结核分枝杆菌（M.tuberculosis）
牛分枝杆菌（M.bovis）
非洲分枝杆菌（M.africanum）
坎纳分枝杆菌（M.canettii）
田鼠分枝杆菌(M.microti)等
前四种对人类致病，其中人型MTB感染率最高
二、临床意义
大约1/3的人口已感染MTB 有2000万活动性结核病患者
每年新发病900万人，死于结核病300万人
近年来，AIDS的发病率上升，AIDS患者又极易患结核病，结核病已成为威胁人类健康的一个严重的全球性公共卫生问题WHO已把结核病与AIDS、疟疾一起列为人类的最主要杀手
(一)所致疾病
通过呼吸道、消化道和损伤的皮肤等多途径 感染机体，引起多种脏器的结核病，其中以肺结核为多见(二)免疫性
有菌免疫或称传染性免疫 细胞免疫
迟发型超敏反应(三)变异
• 结核分枝杆菌易发生形态、菌落、生长温度、毒力以及耐药性的变异
• 卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）是有毒力的牛型结核分枝杆菌在甘油、胆汁和马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒变异株 • 现已广泛用于人类结核病的防治 •
二、临床意义(四)耐药性
• 对常见抗菌药物天然耐药
• 多重耐药结核病(multiple-drug resistance tuberculosis，MDRTB)是指对2种或2种以上的抗结核药产生耐药性的结核菌感染。临床治疗相当棘手，死亡率很高
三、微生物学检验
（一）基本特性
结核分枝杆菌尚未发现产生内毒素、外毒素及侵袭性酶
• 致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症、代谢物质的毒性以及菌体成分引起的免疫损伤有关
• 结核分枝杆菌的致病物质主要是荚膜、脂质和蛋白质
（二）标本采集
• 据感染部位的不同采集不同的标本
• 疑肺结核：收集清晨第一口痰，清洁干燥的容器内送检
• 疑泌尿系结核：清晨一次全部尿量或24小时尿沉淀10～15ml送检，必要时作无菌导尿送检（诊断泌尿道结核通常需3～5份标本）
• 采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物,深部脓肿用无菌注射器抽取送检
• 其他：无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛无菌试管送检。脑脊液标本静置后，表面可有细薄凝块，取凝块作涂片或接种培养
（三）标本直接检查
1.形态学检查
（1）直接涂片染色镜检
（2）浓缩集菌涂片检查法
2.核酸检测 • 形态学检查
• 齐-尼染色（Ziehl-Neelsen technique）是常用的抗酸染色法，染色后结核分枝杆菌呈红色，背景呈蓝色 • 形态学检查
• 用荧光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下菌体呈橘黄色 • 用PCR法快速诊断MTB感染
• PCR法检测DNA特异性更强，敏感性更高
• PCR须按法规要求规范操作，应防止标本污染出现假性结果
（四）分离培养与鉴定
1.培养特性
– 专性需氧– 3％～5％CO2能促进其生长
– 营养要求高:须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及含某些无机盐类的特殊培养基上才能生长良好。常用罗氏培养基
– 最适生长温度为35～37℃，最适pH6.5～6.8 – 14～18h分裂1次，在固体培养基上2～5周才出现肉眼可见的菌落
– 典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透明，乳白色或淡黄色，如菜花样
2.分离培养
• 标本接种于选择性培养基中(常用罗氏，所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长)• 37℃，5％～10％CO2培养8周• 结核杆菌出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落 • 涂片染色为抗酸阳性 •
三、微生物学检验 3.菌种鉴定(1)生化反应
（2）噬菌体鉴定法
（3）分子生物法菌种鉴定
(4)高效液相色谱（HPLC）检测分枝菌酸
• 生化反应--烦琐、费时（4～8 周）,影响因素多 • 结核分枝杆菌不发酵糖类 • 能产生触酶
• 人型MTB能合成烟酸，还原硝酸盐，耐受噻吩-2-羧酸酰肼，而牛型MTB则不能 • 人型和牛型的毒株中性红试验均阳性，无毒株则为阴性，并失去索状生长现象 • 噬菌体鉴定法（PhaB）
• Wilson 等于1997年建立的快速检测新技术
• 原理：是分枝杆菌噬菌体D29能感染活的分枝杆菌,未进入感染菌体内的噬菌体被随后加入的杀毒剂灭活 ,已进入菌体内的噬菌体不受影响。噬菌体在感染菌体内大量增殖 ,并将菌体裂解 ,释放出的子代噬菌体可感染随后加入的指示细胞 ,并将其裂解 ,在琼脂平板上出现透亮的噬菌斑。
• 分子生物法菌种鉴定
• PCR 限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）• PCR单链构象多态性分析（PCR-SSCP）• 核酸探针 • 核酸序列分析 • 多重PCR • 高效液相色谱（HPLC）
• 检测分枝菌酸：由于不同种的分枝杆菌细胞壁中的分枝菌酸不同，所以利用HPLC检测分枝菌酸可鉴定菌种。•
三、微生物学检验
（五）免疫学诊断 1．结核菌素试验
2．结核分枝杆菌抗原检测 3.结核分枝杆菌抗体检测 4.全血干扰素测定法
结核菌素试验
• 针对旧结核菌素(OT)与结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)两种菌体蛋白
• 原理：当将蛋白注入皮内后，如受试者已感染结核杆菌，则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合，在局部释放淋巴因子，形成迟发性超敏反应性炎症，若受试者未感染MTB则无反应。结核分枝杆菌抗原检测
• 用ELISA 方法在血清中检测结核分枝杆菌抗原-结核菌外分泌特异性抗原(external secreted specific antigen)浓度。
• 任何体液如血液、痰液、脊髓液、尿液和各式组织萃取液等体液可用于检测特异蛋白抗原。结核抗体
• 作为活动性MTB感染的快速诊断方法之一
• 比传统的痰涂片抗酸染色、MTB培养等方法简便、快速、敏感性高，但存在一定的假阳性。• 近年，胶体金、蛋白芯片检查结核杆菌IgG抗体抗体，特别是后者，针对三种抗原（脂阿拉伯甘露糖、38K Da和16K Da蛋白质抗原），其灵敏度和特异性均有所提高。全血干扰素测定法
• 原理：当全血与PPD和对照抗原（植物血凝素）共同孵育后，致敏的淋巴细胞可分泌IFN-γ，通过检测IFN-γ的含量来鉴定菌种。
• 2004年，Quantiferon-TB Gold aay 问世，应用结核分枝杆菌RD1区域编码的早期分泌抗原靶（ESAT）和培养滤液蛋白（CFP-10）特异抗原刺激细胞检测。
• 近来ESAT/CFP-10融合蛋白-ELISPOT用于诊断活动性结核病，准确、灵敏、特异、快速。• 结果与结核菌素试验相当，干扰因素小。
（六）药物敏感性试验
• 将纯培养物菌悬液，接种含各种浓度药物的固体培养基上，同时做不含药物的对照组。• 经过培养，含有药物的培养基上菌落数目是对照组的75％以上，则认为该菌对该药物浓度为完全耐药，如无菌落生长则为敏感。
【小结】
结核分枝杆菌为专性需氧，营养要求较高。生长缓慢，在固体培养基上2～5周才出现肉眼可见的菌落。典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透明，乳白色或淡黄色，如菜花样。微生物检验包括染色镜检、核酸检测、分离培养、鉴定试验、免疫学诊断和药物敏感性试验。
【课后预习】非结核分支杆菌，放线菌、卡诺菌 【课后作业】
1、如何进行结核分支杆菌的微生物学检验？
2、结核菌素试验的原理是什么？
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