课题申请书_全国课题申请书
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基于基因芯片技术的水产品病害微生物的快速检测方
法
一、立项依据
渔业，一直是海洋开发的先驱产业。中国的渔业发展历史悠久但起点低，特别是近海高强度捕捞使优势资源损失殆尽，传统的四大渔业已经不复存在，与捕捞业的产量下降相对应的是养殖产量的大幅攀升，其在2006年首次超越渔业捕捞量，发展势头迅猛。中国的水产品产量占世界总量的比重已从1961年的7%上升为2010年的35%。当前水产养殖业居功至伟，2010年我国海（淡）水养殖渔业总产量3828万吨，占世界水产养殖总产量60%以上，总产值4000多亿元。水产品也一直是大宗农产品出口的龙头。自2002年起，中国一直是最重要的水产品出口国，在2010年水产品出口总量716万吨，占世界水产品出口总量近12%的份额，出口额约为133亿美元，2011年又增长至171亿美元[5-6]。
然而同规模、产量的风光相对比是整个产业养殖模式的低效和种种的弊端。大多数企业和私人养殖户还停留在产业的底层，以传统粗放式养殖模式为主，养殖品种单一，产品同质化严重，缺乏新品种的开发；受外界气候、市场影响波动大，绿色化、现代化程度不够。近年来，在新形势下涉海重大项目建设占用海域规模不断扩大，工业、渔业用海矛盾日益突出，传统粗放式养殖业发展受到严重制约，而且传统养殖业所存在疾病传染、滥用药物、种质退化、环境污染等问题愈发突出，有待革新。
特别是近年来随着人们生活水平的提高，食品安全已经成为社会关注的热点。由于渔业管理的缺失，养殖业滥用渔药（抗生素等）的弊端在几次轰动全国的事件得到放大（“多宝鱼”、“小龙虾”事件），而这些事件背后折射的是整个水产养殖环境的不佳、养殖模式和养殖观念的落后。2005年《中国水产养殖病害监测报告》[1]指出我国水产养殖动物生物源性疾病种类达165种，每年造成100亿元以上的直接经济损失，这还不包括因为病害威胁导致的生产收缩和产品质量安全下降所带来的损失。
此外，在国际贸易中，水产疫病问题和因疫病防治带来的药物残留问题，已多次成为欧洲、日本、美国等发达国家对我国水产品出口制造障碍的技术壁垒，我国也在利用这一技术手段保护国家进口水产的安全。如澳洲检疫处(AQIS)曾1次提出要检测16种病害，从国外进口中国的鱼卵也要求检测5～6种病害。OIE在世界食品、动物产品等贸易中的地位越来越重要，2006年的OIE(水生动物健康法典》中列出了24种水生动物疫病必须申报，《水生动物疫病诊断手册》中则包括了34种鱼类、甲壳类和贝类疫病。国际趋势和国内产业发展都对水产病害诊断技术提出了高通量、快速、高灵敏度的迫切要求[2]。
传统的病原微生物检测方法（一般是针对细菌）基于细菌的生物化学特征或者免疫技术，一般使用特定的培养基分离培养根据菌落特征进行判断、再进行一系列的生理生化特征测试验证其种类。其缺点是分离培养费时费力，还有许多病原微生物无法在培养基上接种生长从而导致疏漏；其次特异性不高，结果可能会出错（在不同的环境下细菌可能会选择表现他们的生物学特征）[3]。
原核微生物的16S rRNA基因具有高度的保守性，经常用来鉴定菌种，使用
PCR扩增、测序16S rRNA基因也是当前使用较多的检测方法[4]。PCR法较传统方法效率提升很多，但其检测能力是其一大弊端。多重PCR法虽然有一定提升，但仍受限于琼脂糖电泳的分辨率，灵敏度达不到要求[3]。
基因芯片(Gene chip)又称DNA芯片(DNA microarray)，是专门用于核酸检测的生物芯片，也是目前运用最广泛的微阵列芯片。其概念来自计算机芯片，是指在固相载体(玻片、硅片或硝酸纤维素膜等)上按照特定的排列方式固定大量已知序列的DNA片段或寡核苷酸片断，形成微矩阵。将样品基因组DNA／RNA通过体外逆转录、PCR／RT—PCR扩增等技术掺人标记分子后，与位于微阵列上的已知序列杂交，通过激光共聚焦显微扫描技术或高性能冷冻CCD显微摄像技术，检测杂交信号强度，经计算机软件进行数据的比较和综合分析后，即可获得样品中大量基因序列特征或基因表达特征信息。
作为基因检测手段之一，基因芯片在微生物的鉴定、基因分型、快速诊断等方面有广阔的应用前景。它的优越性主要有：(1)检测样品为各类致病基因片段，提高了检测效率；(2)无需机体免疫反应，做到尽早诊断，且检测样品用量少；(3)诊断芯片技术是DNA杂交技术和PCR扩增技术相结合的分子诊断方法，有极高的灵敏度、特异性和可靠性；(4)自动化程度较高，有利于大规模推广应用；(5)寡核苷酸芯片还可用于对病原体进行基因分型[2]。
基因芯片的技术已经出现了数十年，尽管其最初的设计目的是用来基因组基因的表达分析，但近十年来芯片技术正广泛应用于病原菌的检测。其与传统培养鉴定和16S r RNA测序鉴定相比，具有高效、高灵敏度、高通量的特点，这使得其应用于水产养殖行业也是大势所趋。
二、研究内容
1)选取细菌、原生动物、真菌、病毒四类微生物作为检测目标，结合已有文献报道和同源性推测，筛选一系列的毒力基因、抗药基因、高度保守用于鉴定种类的基因序列。
2)建立目标物种的16S/18S rRNA等保守序列、毒力基因、抗药基因数
据库。探究优化不同生物体的不同基因的实验条件。
3)研究设计多种特异探针，可以有效识别目的基因的多种差异类型又
保证检测的特异性。
4)研究芯片杂交信号强度与环境中存在量的关系，芯片最高灵敏度达
到1CFU/ml。
5)研究建成基因芯片标准化生产线，改进优化制备条件，使产品能够
直接应用于生产实际。
三、实施方案
1．基因芯片的建立、验证、改进
1)建立目标物种的16S/18S rRNA等保守序列、毒力基因、抗药基因数据库
根据近十年来水产养殖业疾病发生情况，初筛常见病原微生物物种范围（包括细菌、原生动物、病毒、真菌），选定目的基因类型。设计特定引物进行PCR/多重PCR反应，扩增目的基因片段，并测序鉴定结果。
2)探究优化不同生物体的不同基因的实验条件
结合已知文献和数据库中的目的基因的不同序列，设计相应的引物，试验扩增结果并校正。
3)设计探针
根据校正后的探针和扩增出的目的基因序列设计探针，探针设计的原则：特异性、覆盖度（考虑变异）、准确性、灵敏度。
4)根据已有病原样本鉴定芯片可靠性、灵敏度。
5)扩大物种范围，重复以上步骤。
6)设计实验建立芯片杂交信号强度与环境中存在量的关系图。
2．实际染病样本检测与对比
检测实际水产环境中的病害，检测对象包括鱼、甲壳类、贝、海参、海胆、养殖水体过滤生物等多种水产品及环境样本，验证芯片可靠性。同时就样本分别使用传统培养方法和16S rRNA测序鉴定法
四、可行性分析
1.对多样化物种的基因获得的可行性分析
本实验室自2000年以来已收集冻藏了近千株分离自中国沿海以及东南亚沿海的病原微生物，并已进行了相关毒力基因和抗性基因的测序和转化工作，相关实验条件的研究已经成熟；也具备从样本中分离检测的能力。
2.设计符合要求的探针的可行性分析
目前已进行的相关毒力基因和抗性基因的测序工作为探针的设计打下了良好的基础，但高灵敏度的基因芯片对探针要求极高，可以说探针的质量直接关系到结果的好坏，3.可靠性结果的可行性分析
按照质量认证体系对整个实验流程严格管控，建立标准化流程体系。
五、创新性
针对基因芯片的研究已有很多，但本课题的创新之处在于：
1.本基因芯片的检测范围覆盖广，基本涵盖已知的病原微生物；
2.本基因芯片主要以毒力基因、抗药基因为主要检测对象，在鉴别微生物种类的同时，更鉴定了微生物是否携带毒力基因、抗药基因，这对疾病防治的帮助极大；
3.本基因芯片的高灵敏度使得可以达到根据荧光信号推测环境种群数量的目的，这对水产养殖业的疾病预防控制将是极大推动；
4.本研究还推行标准化量产技术，直接面向生产应用。
综上所述，本研究的技术性、创新性极强，极具实用价值。
六、参考文献：
[1].陈爱平, 2006 年中国水产养殖病害监测报告 [J].科学养鱼, 2007(9): p.48-49.[2].许拉, 黄健, 杨冰, 病原检测基因芯片应用及在水产病害检测的前景[J].海洋水产研究, 2008.29(1): p.109-114.[3].Severgnini, M., et al., Advances in DNA microarray technology for the detection of foodborne pathogens[J].Food and Bioproce Technology, 2011.4(6): p.936-953.[4].Shi Y.H., et al., Detection of bacterial pathogens in aquaculture samples by DNA microarray analysis[J].Aquaculture, 338-341,(2012).p29-36.[5] FAO, The State of World Fisheries and Aquaculture 2012[R],Roma,2012:p2-10.[6]中国农业部渔业局, 2011中国渔业统计年鉴[R], 北京：中国农业出版社, 2011, p1-4.
