沙祖敏实习论文_沙磊桂林实习论文
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六盘水市牛O型、A型、亚Ⅰ型口蹄疫及隐性感
染免疫抗体调查
送检单位:六盘水疫病预防控制中心
送检材料:牛血清样本
检测时间：6月24日至7月8日 检测地点:三教三楼
检测内容：为了解该地区牛主要疫病免疫水平及隐性感染情况，六盘水市动物疫病预防控制中心特采集六盘水市临床健康牛血清，于2012年6月24日送检至贵州大学三教三楼实验室进行相关血清学监测，检测牛主要疫病隐性感染抗体和免疫抗体阳性率。
一、实验步骤
（一）、牛O型口蹄疫检测
1、先按1:25稀释PBST浓缩液1000毫升，40毫升PBST浓缩液+960毫升蒸馏水。
2、稀释血清1：32，20微升待检血清+620微升PBST于1.5毫升印管内，在吸取血清样本时要充分混匀，加好样后瞬时离心。
3、取50微升稀释好的血清到血清稀释板中，第11，12列作阴性，阳性，病原对照孔。第11列各孔加50微升PBST,再加阳性血清50微升，等比稀释，第12列前两孔各加50微升PBST，再加阴性血清50微升，等比稀释。
4、A型口蹄疫病毒抗原按1：6的比例稀释。
5、每孔各加稀释好的病毒抗原50微升，第10列对照孔最后四孔各加100微升。
6、4摄氏度过夜。
7、用包被缓冲液按1：1000稀释病毒免抗血清，在ELISA包被板上每孔加50微升，室温过夜。
8、用洗涤液（1xPBST）洗ELISA板5次，在吸水纸上甩干，抗原体反应从4摄氏度取出放置5分钟后，将各孔血清病毒混合物按次序转移至ELISA板上，每孔50ul，封板，37摄氏度温1小时。
9、同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释A型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度1：1000,每孔加50微升，封板，37摄氏度温育1小时。
10、同上洗板5次，甩干。用PBST稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度1：500, 每孔加50微升，封板，37摄氏度温育1小时。
11、同上洗板5次，每孔加50微升底物溶液，(务必要加双氧水，每10毫升加100微升双氧水)，37摄氏度温育15分钟。每孔再加50微升硫酸
终止液终止反应，立即在492nm波长下读取光吸收值。【结果判定】
1、实验认可标准
每次实验，每块板必须设病毒抗原对照和阴阳性血清对照。病毒抗原对照至少两个孔的492nm值为1.0以上，最好在1.0-2.0范围内；阳性对照抗体滴度应是1:1024+-1滴度；阴性对照抗体滴度应小于1:4.2、病毒抗原对照平均429nm值50%计算
抗原对照是4孔。弃去最高和最低值，计算剩余2孔的平均值再除以2，即50%对照值。该值即为临界值，表示了阻断50%反应的对照值。
3、结果判定
以病毒抗原对照平均值得50%为临界值，被检血清稀释孔的值大于临界值的孔位阴性孔，小于或等于临界值的孔位阳性孔，阳性孔492nm波长值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均值为1.2，则其50%为0.6。若某一待检血清在1:128时492nm波长值为0.6，则该份血清的抗体滴度为1:128.若临界值处于两个之间，如处于1:64与1:128之间，则该抗体滴度取中间值为1:90。
ELISA抗体滴度与免疫动物攻毒保护的关系：牛、羊;抗体滴度》=1:128,99%以上保护《1:16不保护；1:22-90.50%保护。猪：》=1:64,99%以上保护；《1:4不保护；1：4-45,50%保护。
（二）、牛A型口蹄疫检测
1、先按1:25稀释PBST浓缩液1000毫升，40毫升PBST浓缩液+960毫升蒸馏水。
2、稀释血清1：32，20微升待检血清+620微升PBST于1.5毫升印管内，在吸取血清样本时要充分混匀，加好样后瞬时离心。
3、取50微升稀释好的血清到血清稀释板中，第11，12列作阴性，阳性，病原对照孔。第11列各孔加50微升PBST,再加阳性血清50微升，等比稀释，第12列前两孔各加50微升PBST，再加阴性血清50微升，等比稀释。
4、A型口蹄疫病毒抗原按1：6的比例稀释。
5、每孔各加稀释好的病毒抗原50微升，第10列对照孔最后四孔各加100微升。
6、4摄氏度过夜。
7、用包被缓冲液按1：1000稀释病毒免抗血清，在ELISA包被板上每孔加50微升，室温过夜。
8、用洗涤液（1xPBST）洗ELISA板5次，在洗水纸上甩干，再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相应孔，每孔50微升，封板，37摄氏度温育1小时。
9、同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释A型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度1：1000,每孔加50微升，封板，37摄氏度温育1小时。
10、同上洗板5次，甩干。用PBST稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度1：1000, 每孔加50微升，封板，37摄氏度温育1小时。
11、同上洗板5次，每孔加50微升底物溶液，(务必要加双氧水，每10毫升加100微升双氧水)，37摄氏度温育15分钟。每孔再加50微升终止液终止反应，立即在492nm波长下读取光吸收值。【结果判定】
1、实验认可标准
每块板设4孔病毒抗原对照。病毒抗原对照不加任何血清，直接用PBST稀释至使用浓度，与血清或病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔，50ul每孔，病毒抗原对照值应在1.5+-0.5范围内。阳性对照抗体效应在1:1024+-1滴度以内；阴性对照抗体效应《1:8。
2、病毒抗原对照平均429nm值50%计算
抗原对照是4孔。弃去最高和最低值，计算剩余2孔的平均值再除以2，即50%对照值。该值即为临界值，表示了阻断50%反应的对照值。
3、结果判定
以病毒抗原对照平均值得50%为临界值，被检血清稀释孔的值大于临界值的孔位阴性孔，小于或等于临界值的孔位阳性孔，阳性孔492nm波长值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均值为1.2，则其50%为0.6。若某一待检血清在1:128时492nm波长值为0.6，则该份血清的抗体滴度为1:128.若临界值处于两个之间，如处于1:64与1:128之间，则该抗体滴度取中间值为1:90。ELISA抗体效价》=1:128，判为A型口蹄疫抗体阳性。
ELISA抗体效价与保护力的关系：牛、羊：抗体效价》=1:128,99%保护，效价《=1:16，不保护；效价在1:22-90间，50%保护。
（三）、牛亚洲I型口蹄疫检测
1、先按1:25稀释PBST浓缩液1000毫升，40毫升PBST浓缩液+960毫升蒸馏水。
2、稀释血清1：32，20微升待检血清+620微升PBST于1.5毫升印管内，在吸取血清样本时要充分混匀，加好样后瞬时离心。
3、取50微升稀释好的血清到血清稀释板中，第11，12列作阴性，阳性，病原对照孔。第11列各孔加50微升PBST,再加阳性血清50微升，等比稀释，第12列前两孔各加50微升PBST，再加阴性血清50微升，等比稀释。
4、亚洲I型口蹄疫病毒抗原按1：5的比例稀释。
5、每孔各加稀释好的病毒抗原50微升，第12列最后四孔各加病毒抗原100微升，作为抗原对照。
6、4摄氏度过夜。
7、用包被缓冲液按1：1000稀释病毒免抗血清，在ELISA包被板上每孔加50微升，室温过夜。
8、用洗涤液（1xPBST）洗ELISA板5次，在洗水纸上甩干，再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相应孔，每孔50微升，封板，37摄氏度温育1小时。
9、同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释A型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度1：1000,每孔加50微升，封板，37摄氏度温育1小时。
10、同上洗板5次，甩干。用PBST稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度1：1000, 每孔加50微升，封板，37摄氏度温育1小时。
11、同上洗板5次，每孔加50微升底物溶液，(务必要加双氧水，每10毫升加100微升双氧水)，37摄氏度温育15分钟。每孔再加50微升终止液终止反应，立即在492nm波长下读取光吸收值。【结果判定】
1、实验认可标准
每块板设4孔病毒抗原对照。病毒抗原对照不加任何血清，直接用PBST稀释至使用浓度，与血清或病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔，50ul每孔，病毒抗原对照值应在1.5+-0.5范围内。阳性对照抗体效应在1:1024+-1滴度以内；阴性对照抗体效应《1:8。
2、病毒抗原对照平均429nm值50%计算
抗原对照是4孔。弃去最高和最低值，计算剩余2孔的平均值再除以2，即50%对照值。该值即为临界值，表示了阻断50%反应的对照值。
3、结果判定
以病毒抗原对照平均值得50%为临界值，被检血清稀释孔的值大于临界值的孔位阴性孔，小于或等于临界值的孔位阳性孔，阳性孔492nm波长值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均值为1.2，则其50%为0.6。若某一待检血清在1:128时492nm波长值为0.6，则该份血清的抗体滴度为1:128.若临界值处于两个之间，如处于1:64与1:128之间，则该抗体滴度取中间值为1:90。ELISA抗体效价》=1:128，判为A型口蹄疫抗体阳性。
ELISA抗体效价与保护力的关系：牛、羊：抗体效价》=1:128,99%保护，效价《=1:16，不保护；效价在1:22-90间，50%保护。
（四）、牛口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC-ELISA检测
1、使用前将试剂盒恢复到室温，避免阳光直射或放置在30摄氏度以上的环境中。
2、取出试剂盒中的样品稀释板。A1、B1两孔作为阴性对照，C1、D1两孔作为阳性对照孔，其余孔作检测孔，每孔一个样品。
3、在稀释板的A1、B1、C1、D1孔中加入200微升样品稀释液，在相应的孔中分别加如10微升阴、阳性对照血清。在稀释其它各孔中加入155微升样品稀释液，在相应的各孔中分别加入5微升待检样品血清。用加样器重复吹吸数次。稀释每个样品时必须使用不同的吸头。
4、取出抗原包被板。
5、分别从稀释板上取稀释后的对照血清和被检血清各100微升，加至抗原包被板的相应孔中，加盖或封膜后，置于37摄氏度孵育60分钟。
6、洗涤工作液配制：按需要量，用离子水或双蒸水将洗涤液作25倍稀释。
7、用洗涤工作液洗涤抗原包被板，每孔加300微升，洗涤6次，拍干。
8、酶结合物工作液配制：用酶结合物稀释液将酶结合物作100倍稀释，现配现用。
9、每孔加100微升酶结合物工作液，加盖或封膜后，置37摄氏度下孵育30分钟。
10、重复7。
11、TMB底物工作液配制：将TMB底物B液和TMB底物A液等量混合。现配现用。
12、每孔加入100微升TMB底物工作液，加盖或封膜后，置37摄氏度下孵育15分钟。
13、每孔加入100微升终止液，并轻轻振荡混匀。
14、在15分钟内，用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD值。
